紫外分光光度法蛋白酶酶活

1、紫外分光光度法蛋白酶酶活作者:日期:紫外分光光度法測蛋白酶酶活2013/1、原理蛋白酶在一定的溫度與 pH條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對紫外光有吸收， 可用紫外分光光度法測定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以（u/mL）表示。2、試劑和溶液三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乳酸、乳酸鈉、硼酸鈉（硼砂）均 為分析純，酪素、酪氨酸為生化試劑。1.1 三氯乙酸 c （CCL3 - COOH =0.4mol/L稱取三氯乙酸65.4g

2、,用水溶解并定容至 1000 mLo1.2 氫氧化鈉溶液 c （NaOH =0.5mol/L按GB601配制。1.3 鹽酸溶液 c （HCD = 1 mol/L 及 0.1 mol/L1 mol/L H C L :取90mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至 1000mL0.1 mol/L H CL:取9mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL1.4 緩沖溶液a、磷酸緩沖液（pH= 7.5）適用于中性蛋白酶稱取磷酸氫二鈉（NaHPO- 12H2O） 6.02g和磷酸二氫鈉（NaHPQ 12H2O） 0.5g ,加水溶解 并定容至1000mL3b、乳酸緩沖液（pH= 3.0）適用于酸性蛋白酶甲

3、液稱取乳酸（80%90%） 10.6g,加水溶解并定容至 1000 mLo乙液稱取乳酸鈉（70%） 16g,加水溶解并定容至1000 mLo使用溶液取甲液8 mL,加乙液1 mL,混勻，稀釋一倍，即成 0.05moi/L乳酸緩沖溶液。c、硼酸緩沖溶液（pH= 10.5）適用于堿性蛋白酶甲液稱取硼酸鈉（硼砂）19.08g ,加水溶解并定容至 1000 mLo乙液 稱取氫氧化鈉4.0g ,加水溶解并定容至 1000 mLo使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混勻，用水稀釋至 1000mL上述各種緩沖溶液，均須用pH計(jì)校正。1.5 10g/L酪素溶液稱取酪素1.000g ,精確至0.001g

4、 ,用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸23滴）濕潤后，加入適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80 mL在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的pH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。1.6 100ug/mL L酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液a、稱取預(yù)先于 105c干燥至值重的 L酪氨酸0.1000g ,精確至0.0002g ,用1mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL,即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。b、吸取1mg/ mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 10.00 mL,用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL

5、L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用。3 儀器和設(shè)備3.1 恒溫水浴40±0.2C。3.2 紫外分光光度計(jì)應(yīng)符合GB 9721的規(guī)定。4 分析步驟4.1 求K值按下表配制不同濃度的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計(jì)于275nm測定其吸光度（A）,以吸光度 A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度 c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過零點(diǎn)），根據(jù)作圖或用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量（科g）,即為吸光常數(shù)K值；（其K值應(yīng)在（130135）范圍內(nèi)）。管 號(hào)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃 度（g g/mL）取100ug/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積mL取水的體積mL吸光值A(chǔ)bs.000

6、1011019220283303744046550554.2 測定吸取適量稀釋的酶?夜2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL ,其它操作條件同福林法測定中的反應(yīng)、靜止沉淀，直到過濾。濾液用紫外分光光度計(jì)，在275nm波長下，用10mm比色皿，測定其吸光度（A）。a、先將酷素溶液放入 40±0.2 C恒溫水浴中，預(yù)熱 5min；b、按下列程序操作：試管A （空白）試管B （酶試樣，需作三個(gè)平行試樣）加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL40±0.2C, 2min加三氯乙酸4.00 mL （搖勻）40±0.2 C, 10min （精確計(jì)時(shí)）加酪素2.

7、00mL（已預(yù)熱）（搖勻）繼續(xù)加熱10min,過濾或離心于275nm波長，測上清液吸光值40±0.2C, 2min加酪素2.00mL（已預(yù)熱）（搖勻）40±0.2 C, 10min （精確計(jì)時(shí)）加三氯乙酸4.00mL （搖勻）繼續(xù)加熱10min ,過濾或離心于275nm波長，測上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為30±0.2C外，其它操作同 4.2 。標(biāo)準(zhǔn)曲線 作同樣處理。5 計(jì)算在40 c下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1科g酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。X= AX KX 8/2 X 1/10 XnXE= 2/5 X AX KX nXE式中：X樣品的酶活力，（u/mL）;A試樣溶液的平均吸光度；K 吸光常數(shù)；8 反應(yīng)試劑的總體積，mL2 吸取酶液 2.