松花粉對人胚肺二倍體成纖維細胞p16及p21基因表達的影響

1、松花粉對人胚肺二倍體成纖維細胞p16及p21基因表達的影響【摘要】 目的研究松花粉對衰老細胞(2BS)內(nèi)細胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF1基因mRNA表達的影響。方法2BS細胞從28代開始培養(yǎng)，隨機分成年輕對照組（30代）、衰老模型組（56代）、松花粉中劑量（120mg/dl）組（56代）、松花粉高劑量(240mg/dl)組（56代）。流式細胞術分析細胞周期，檢測G1期比例；半定量RTPCR法測定p16INK4a、p21WAF1mRNA的表達。結果衰老模型組細胞出現(xiàn)典型的細胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則；松花粉處理組細胞，體積回縮，形態(tài)趨于規(guī)則。G1期細胞比例松花粉中劑量組(72.

2、73%±1.76%)和高劑量組(64.15%±0.87%)較衰老模型組(81.33%±3.43%)顯著下降(P<0.05)。細胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4amRNA的表達量在松花粉中劑量組(0.3483±0.0078)和高劑量組(0.3222±0.0055)較衰老模型組(0.3974±0.0078)表達灰階明顯下調(diào)。p21WAF1mRNA的表達量在松花粉中劑量組(0.7692±0.1749)和高劑量組(0.4451±0.0363)較衰老模型組(1.1767±0.2782)。結論松花粉具

3、有改善細胞衰老的作用，其分子機制可能與下調(diào)衰老細胞內(nèi)細胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF11mRNA的表達從而改善衰老細胞G1期阻滯有關。 【關鍵詞】 松花粉;細胞衰老;細胞周期;p16;p21Abstract：ObjectiveTo observe the effects of pine pollen on the changes of p16INK4a and p21WAF1 in 2BS cells.MethodThe 2BS cells were cultured from 28 population doubling(PD) and divided equally i

4、nto the young control group, old control group, middledose pine pollen group(120mg/dl) and highdose pine pollen group(240mg/dl)randomly.Regulate the phases of cell cycle by flow cytometry，and then the expression of p16INK4a，p21WAF1 mRNA were determined by semiquantitative RTPCR.ResultThe amount of c

5、ells in G1 phase was depressed in middledose pine pollen group (72.73%±1.76%) and highdose pine pollen group (64.15%±0.87%) than in old control group (81.33%±3.43%)noticeablely (P<0.05).The expression of p16INK4amRNA in middledose pine pollen group(0.3483±0.0078) and highd

6、ose pine pollen group (0.3222±0.0055) was significantly decreased than in old control group(0.3974±0.0078,P<0.05)；The level of p21WAF1mRNA in middledose pine pollen group(0.7692±0.1749) and highdose pine pollen group (0.4451±0.0363) was significantly lower than in old cont

7、rol group(1.1767±0.2782,P<0.05).ConclusionPine pollen has the antiaging effect on aging 2BS cells, this effect may be reacted via decreasing the expression of p16INK4a and p21WAF1mRNA levels in aging cells, and then down regulating the amount of cells blocking in G1 phase of cell cycle.K

8、ey words：pine pollen；cell aging；cell cycle；P16；P21 細胞復制性衰老是目前普遍接受的細胞衰老理論，其最顯著的特征即細胞出現(xiàn)G1期阻滯。在細胞衰老過程中細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子（CDKI）發(fā)生表達量的改變。其中p16INK4a及p21WAF1是細胞衰老誘導途徑中的兩個關鍵產(chǎn)物，被稱為衰老相關基因1。其表達量與衰老的表型及衰老進程密切相關，作為檢測細胞衰老的分子指標應用于衰老相關檢測。松花粉是天然的營養(yǎng)寶庫，已有的研究發(fā)現(xiàn)，松花粉對人胚肺二倍體成纖維細胞有促進增殖2，并提高端粒酶活性3的作用。本實驗探討松花粉對衰老2BS細胞中細胞周期及細胞周期蛋

9、白激酶抑制劑p16INK4a及p21WAF1mRNA表達量的影響。為研究松花粉抗細胞衰老的分子機制及衰老通路選擇提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細胞培養(yǎng)、分組與處理 2BS細胞由北京生物制品研究所建株，28代引入。培養(yǎng)于15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，37,5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中生長。細胞壽限為6070代。至30代時隨機取8瓶作為年輕對照組，至56代時隨機取24瓶分成衰老模型組、松花粉中劑量組、松花粉高劑量組3組每組8瓶，分別以單純完全培養(yǎng)基、120mg/dl含花粉血清培養(yǎng)基、240mg/dl的含花粉血清培養(yǎng)基培養(yǎng)8天3，收集細胞。配制松花粉血清液，使其終濃度分別為1

10、20mg/dl與240mg/dl。1.1.2 儀器與試劑 FACScan流式細胞儀(Beckman coulter);PCR儀（ABI9700）；凝膠成像儀（BioRad）。類標準胎牛血清（FBS）購自民海生物，MEM培養(yǎng)基（含非必需氨基酸、谷胺酰胺）為invitrogen產(chǎn)品。流式細胞周期檢測試劑盒（上海杰美）；cDNA試劑盒（invitrogen，superscriptIII逆轉錄試劑盒）。1.2 方法1.2.1 細胞周期測定 細胞培養(yǎng)至8090融匯時，徹底收集細胞入15ml離心管，1500rpm,5min離心,去上清得細胞沉淀。再按細胞周期流式檢測試劑盒說明進行操作。EXPO32ADC軟

11、件進行檢測（美國Beckman Clouter），Multicycle for windows DNA（美國Beckman,Clouter）軟件行細胞周期分析。1.2.2 RTPCR法檢測p16INK4a及p21WAF1mRNA的表達 p16INK4a、p21WAF1特異基因及actin內(nèi)參基因的引物均由上海生工合成。actin PCR引物4：上游5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3,下游5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3,擴增片段為500bp；p16INK4a PCR引物4：上游5ATGATGATGGGCAGCGCC3,下游5CGAGGTTTCTCAGAGCCT3擴

12、增片段為346bp;p21WAF1PCR引物5:上游5CATTTGGTGGACCCAAAGAC3,下游5CCTCCCTTCCCCAAAGTTTA3,擴增片段為304bp。 RNA提取與測定：采用Invitrogen公司Trizol試劑提取細胞總RNA。紫外分光光度計測定其吸光度值并計算RNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段完整性。 逆轉錄反應：反應總體積為20l，其中總RNA為5l，隨機引物(oligo(dT)1l、MMLV200u、RNase Inhibitor 40u、10mmol/L dNTPs 1l、0.1mmol/L DTT 2l、5×RT buffer 4l。65變性5

13、min后，37溫育50min后，70、15min后終止反應。 PCR反應：反應體系為20l,分別含cDNA模板2.0l、TaqE 0.4l、dNTP 0.25mmol/L、引物1.0l、10×PCR Buffer 2.0l。反應條件：94 5min,94 30s,5662 30s,72 40s,35個循環(huán);最后72延伸10min。其中Actin退火溫度為62；p16INK4a退火溫度為56；p21WAF1退火溫度為56。 取6l PCR擴增產(chǎn)物，2l上樣緩沖液在1%瓊脂糖凝膠電泳上做產(chǎn)物檢測分析,80V,30min電泳，EB染色，以GELDOC2000型紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，對特異基

14、因條帶進行灰度掃描，并對各特異基因/actin的比值進行分析。1.3 統(tǒng)計處理 測定值以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較方差齊性時行單因素方差分析,LSD方法進行多組間兩兩比較；方差不齊時,采用非參數(shù)分析進行多組間比較，Dunnetts T3方法進行多組間兩兩比較，以P0.05定為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 細胞周期 由表1可見，56代較30代2BS細胞G0/G1期細胞比例增加(P<0.001),而120mg/dl與240mg/dl含花粉血清培養(yǎng)基處理組細胞均較衰老模型組G0/G1期細胞比例減少(P<0.05)。 表

15、1 松花粉對2BS細胞細胞周期的影響（略）與56代對照組比較，*P0.05，*P0.01，*P0.001；非參數(shù)方法（KruskalWallis方法）2.2 RTPCR結果2.2.1 總RNA完整性分析 總RNA電泳結果示，4組細胞中提取的總RNA其28S,18S條帶完整，OD260/OD280比值為1.72.0,證明所提取的總RNA片段完整，無蛋白質污染，可用于RTPCR反應。圖1 總RNA電泳圖。（略）1.年輕對照組；2.衰老模型組；3.120mg/dl含松花粉血清組；4.240mg/dl含花粉血清組。2.2.2 p16INK4a及p21WAF1基因mRNA水平p16INK4a和p21WA

16、F1基因RTPCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，進行灰度掃描分析。結果顯示(圖3)，120mg/dl(0.3483±0.0078）與240mg/dl（0.3222±0.0055）含花粉血清組較衰老模型組（0.3974±0.0078）中p16INK4amRNA表達量均顯著下調(diào)（P<0.05）。p21WAF1mRNA表達量在120mg/dl（0.7692±0.1749）與240mg/dl（0.4451±0.0363）含花粉血清組較衰老模型組（1.1767±0.2782）也顯著下調(diào)（P<0.05）。圖2 p16

17、,p21基因PCR電泳圖（略）1.年輕對照組；2.衰老模型組；3.120mg/dl含松花粉血清組；4.240mg/dl含花粉血清組。圖3 p16,p21半定量RTPCR表達量比較（略）3 討論 細胞周期是細胞生命活動中的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細胞周期運轉是十分有序的，沿著G1期S期G2期M期的順序進行，細胞周期具有G1/S與G2/M兩個調(diào)控點，其中G1/S點是啟動細胞周期循環(huán)的關鍵。細胞衰老最顯著的特征是細胞在很長一段時間內(nèi)仍維持代謝活性，但因阻滯于G1期，失去了對有絲分裂原的反應和合成DNA的能力，不能進入S期。 本研究采用自然衰老2BS細胞模

18、型，觀察松花粉的抗衰老作用，結果顯示松花粉干預能明顯改善衰老細胞出現(xiàn)的G1期細胞阻滯，提示松花粉在體外具有一定的抗細胞復制性衰老的作用。因此本研究進一步觀察了細胞周期調(diào)控蛋白p16，p21在此過程中的可能作用。 在衰老細胞中，其細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）、細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CDKI)發(fā)生量與活性的變化。依據(jù)激活的CDKI的不同，可將衰老通路分為以下三條6，包括p16INK4a/RB,p19ARF/p53/p21WAF1,和PTEN/p27通路。已有大量研究表明在人胚肺成纖維細胞的衰老過程中，p16INK4a/RB和p21WAF1通路發(fā)揮著重要作用。

19、當這些途徑所涉及的關鍵因子發(fā)生突變，細胞將延緩衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。 P16是CDK46/D的特異性抑制劑，通過抑制CDK46/D激酶的活性，使RB蛋白保持非磷酸化，減少了轉錄因子E2F的釋放，使細胞內(nèi)不能表達E2F依賴的G1晚期蛋白，使細胞DNA增殖不能通過G1/S調(diào)控點，阻滯在G1期。P16蛋白在正常生長細胞中表達水平較低7，但是在細胞多次復制接近衰老時其表達水平逐漸增高89，2004年Janakiraman K等學者提出P16能作為測定細胞衰老的分子標記以區(qū)別于單從時間上對衰老的界定10。國內(nèi)Jiangming等以p16正反義載體分別轉染年輕的人成纖維細胞（2BS）11，結果示p1

20、6INK4a的積累是衰老的誘因，而不是衰老的結果。進一步研究發(fā)現(xiàn)12，負調(diào)控機制減弱是細胞復制性衰老時p16INK4a基因高表達的重要原因。 本研究觀察松花粉抗細胞衰老過程中p16表達的變化，發(fā)現(xiàn)在松花粉干預處理后衰老細胞的p16INK4amRNA表達量出現(xiàn)明顯的下調(diào)。提示松花粉有可能通過抑制p16INK4a的表達，解除對Rb活性的抑制，促進E2F蛋白的釋放，激活E2F依賴的G1晚期調(diào)控蛋白，促進細胞DNA增殖，改善G1期阻滯。但是松花粉對p16INK4a的抑制作用是否與激活其負調(diào)控元件有關還有待于進一步的研究。 P21WAF1（又名p21CIP1,p21SDI1）則是細胞周期依賴激酶（CDK

21、）的非特異性抑制劑。其一方面具有抑制Rb磷酸化,阻遏E2F釋放,使細胞周期停留在G1/S點不能進入S期的作用；另一方面,可與增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclearantigen,PCNA)結合,使依賴PCNA的DNA復制受阻,致使細胞增殖停滯在G1期13。在衰老細胞中，研究發(fā)現(xiàn)p21WAF1的mRNA比年輕細胞增加1020倍14。 本研究觀察松花粉抗細胞衰老過程中p21WAF1表達的變化情況，發(fā)現(xiàn)松花粉干預后衰老細胞內(nèi)p21WAF1mRNA表達量出現(xiàn)明顯下調(diào)，提示松花粉有可能通過抑制p21WAF1表達，促進細胞周期從G1期向S期進展，而延緩細胞的衰老。但是松花粉具

22、體是通過p21WAF1下游的PCNA途徑、Rb途徑何者起作用以及是否兩條途徑同時起抗衰老作用還有待進一步研究。同時松花粉通過何種機制抑制P21表達也還有待研究。以往的研究表明，p21WAF1隨細胞傳代表達逐漸升高，當p21WAF1升高至一定水平，p16INK4a表達開始升高，而此時p21WAF1表達水平下降，高水平的p16INK4a啟動、維持并推動細胞衰老15。本實驗中，衰老模型組、120mg/dl與240mg/dl的含花粉血清培養(yǎng)基處理組中，p16INK4amRNA的表達量均較p21WAF1mRNA表達量要低，可能與已知的p21WAF1先于p16INK4a表達有關。p21WAF1和p16IN

23、K4a的增加是相繼的，p21WAF1表達增加出現(xiàn)在大多數(shù)細胞喪失增殖潛力時，而p16INK4a表達增加出現(xiàn)在所有細胞喪失增殖潛力時的衰老終末期。p21WAF1能在細胞復制衰老的晚期激活p16INK4a16。p21啟動細胞衰老機制而p16INK4a維持細胞衰老的進程。 總之，本實驗從細胞周期G1期阻滯角度探討了松花粉的抗衰老作用，并進而分析了兩個重要的細胞周期調(diào)控因子p16INK4a與p21WAF1 mRNA表達量的變化情況，提示松花粉可抑制p16及p21的表達，并可能通過釋放其下游的Rb與PCNA蛋白，推進細胞DNA增殖進程，改善衰老細胞G1期阻滯情況，從而達到抗衰老作用?！緟⒖嘉墨I】 1 鄭

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