中國產(chǎn)NDM-1細(xì)菌流行現(xiàn)狀及bla_NDM-1基因跨種屬轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

1、中國產(chǎn)NDM-1細(xì)菌流行現(xiàn)狀及bla_(NDM-1)基因跨種屬轉(zhuǎn)移機(jī)制 研究NDM-理碳青霉烯酶是2022年發(fā)現(xiàn)的一種新型金屬p-內(nèi)酰胺酶,具有對頭抱 菌素及碳青霉烯類抗生素的高效水解活性.至今 ,產(chǎn)NDM-1酶菌株已經(jīng)呈全球范 圍播散,成為嚴(yán)重威脅人類健康的“超級細(xì)菌.但是目前,我國NDM-18株的流行病學(xué)數(shù)據(jù)缺乏,blaNDM-1基因迅速播散的 機(jī)制仍不明確.本研究第一局部對收集于2022年1月至2022年9月間來自全國 18個省市,57家醫(yī)院的非重復(fù)革蘭陰性桿菌12024株,其中大腸埃希菌3439株、 肺炎克雷伯菌2840株、不動桿菌屬細(xì)菌2835株以及銅綠假單胞菌2910株,運(yùn)用 PC

2、曲術(shù)對blaNDM-1基因進(jìn)行篩查.結(jié)果發(fā)現(xiàn)13株菌攜帶有blaNDM-1基因,均為不動桿菌屬細(xì)菌.患者流行病 學(xué)資料回憶性分析結(jié)果顯示：其中 8位患者年齡>60歲、4位<7歲,13位 患者中只有2例發(fā)生死亡；所有患者半年內(nèi)均未有出國旅游史.13株菌來自于10個不同的省份及9個不同的科室,7例來源于痰標(biāo)本、3例 血液、2例分泌物及1例尿液標(biāo)本.篩查結(jié)果提示,在我國NDM-倘株尚未出現(xiàn) 流行,不動桿菌屬細(xì)菌為blaNDM-1基因的重要攜帶菌,這與國外眾多研究結(jié)果不 同.由于不動桿菌屬菌種數(shù)目多、菌種間性狀相似度高 ,該屬細(xì)菌的菌種鑒定一 直是個難點(diǎn).為對13株菌進(jìn)行準(zhǔn)

3、確菌種鑒定,我們除使用生化鑒定外,依次采用 了 blaOXA-51-like 基因、16S-23S rRNA ITS 區(qū)序列、ARDRA!切分析及 rpoB 基因序列分析等四種方法.結(jié)果顯示 13 株菌中,A. baumannii4 株,A. pittii3 株,A. lwoffii 、A. johnsonii 、A. genospecies10、A. haemolyticus 、A. junii 及 A.genospecies15TU各1株.運(yùn)用E-test藥敏條對菌株進(jìn)行抗菌藥物 MIC值測試, 結(jié)果顯示13株不動桿菌菌株對包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有 p-內(nèi)酰胺類抗生素表 現(xiàn)出一致的體外耐藥

4、表型,對氨基糖甘類慶大霉素和阿米卡星、唾諾酮類環(huán)丙 沙星及單環(huán)酰胺類氨曲南等抗生素的藥敏表型有差異,對多粘菌素類多粘菌 素、甘氨酰環(huán)素類替加環(huán)素及四環(huán)素類米諾環(huán)素均表現(xiàn)為敏感.在此根底上,本研究的第二局部內(nèi)容通過 S1-酶切后脈沖場凝膠電泳S1-PFGEX合Southern blot 雜交技術(shù)對13株不動桿菌屬細(xì)菌的blaNDM-1基 因進(jìn)行定位,運(yùn)用質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性；通過酶切克隆 研究blaNDM-1基因的周圍結(jié)構(gòu)；進(jìn)一步運(yùn)用第二代高通量測序技術(shù)完成了ABC8415#株blaNDM-1質(zhì)粒的測序,并根據(jù)pABC841質(zhì)粒序歹設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCR mapping研究其余

5、12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn),對blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 與耐藥基因傳遞間的關(guān)系進(jìn)行了深入探討.本局部實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,所有菌株blaNDM-1基因均定位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小30-55kb.除菌株ABC20憐卜,其余12株菌的blaNDM-1質(zhì)粒均通過接合成功進(jìn)入 E.coli J53接合受體菌中,藥敏結(jié)果提示E. coli J53 接合子對頭抱菌素類抗生素 耐藥,但對碳青霉烯類仍表現(xiàn)為敏感,推測可能是由于供、受體菌間種屬的差異導(dǎo) 致NDM-1酶不能在受體菌E. coli J53中充分表達(dá)所致.9株非鮑曼不動桿菌blaNDM-1質(zhì)粒均能通過轉(zhuǎn)化的方式進(jìn)入電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)菌A. baylyi

6、 ADP1轉(zhuǎn)化子成功獲得NDM-1酶介導(dǎo)對頭抱菌素類及碳青霉烯類抗生素的耐藥性.blaNDM-1基因周圍結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該基因位于具有轉(zhuǎn)移功能的大片段轉(zhuǎn) 座結(jié)構(gòu)Tn125上,該完整的Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)為9個基因的串聯(lián)排列,順序?yàn)椋篒SAba125-blaNDM-1-bleo-trpF-dsbc-cutA1-groES-groEL-ISAba125 .在 13 株菌中發(fā)現(xiàn)了 5種不同大小的轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)命名為I、H、m、IV和V型轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu).此5種轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別是blaNDM-1基因下游序列發(fā)生了不同長度的截短,推測下游拷貝的ISAba125轉(zhuǎn)座酶是參與轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的主要原因；而上游拷貝的ISAba

7、125與blaNDM-1基因關(guān)系密切,構(gòu)成穩(wěn)定的ISAba125-blaNDM-1基因 簇,是介導(dǎo)blaNDM-1基因在不同菌種間傳遞的主要轉(zhuǎn)移酶.為明確ISAba125對blaNDM-1基因轉(zhuǎn)移的作用以及blaNDM-1基因在不同種屬細(xì)菌包括腸桿菌科細(xì) 菌及非發(fā)酵菌中的進(jìn)化關(guān)系,我們從NCBI上公布的、來源于不同菌屬菌種的、 帶有ISAba125-blaNDM-1基因簇的參考序列中挑選出了 9條序列,與本研究中13 條序列進(jìn)行基因相似性聚類分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析親緣關(guān)系.納入的參考序列來源菌種分別為大腸埃希菌2株、弗氏構(gòu)檬酸桿菌1株、普羅威登菌屬2株、鮑曼不動桿菌2株以及銅綠假單胞菌2株

8、.結(jié)果發(fā)現(xiàn)22條序 列分為兩簇Cluster I及H ,9條參考序列與8條本實(shí)驗(yàn)序列均歸入Cluster I 簇,另外5條歸入Cluster II簇,兩簇間親緣關(guān)系非常近,序列相差最多6bp.也就是說ISAba125-blaNDM-1基因簇在不同種屬細(xì)菌中具有穩(wěn)定性,不同種 屬細(xì)菌問ISAba125-blaNDM-1的進(jìn)化關(guān)系是平行的.pABC841質(zhì)粒全長39365bp, 具有31個CDS其中蛋白20個,未知蛋白11個,未找到質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)蛋白.質(zhì)粒結(jié)構(gòu)包括了兩個局部：骨架區(qū)及可變區(qū).骨架區(qū)編碼與質(zhì)粒復(fù)制、轉(zhuǎn)移 及毒力等功能相關(guān)的根本蛋白,GC含量為37.26%;可變區(qū)那么即blaNDM-1基

9、因所 在Tn125轉(zhuǎn)座區(qū),GC含量高達(dá)61.42%.PCR mappin時果揭示其余12株細(xì)菌blaNDM-1質(zhì)粒與pABC841微粒結(jié)構(gòu)非常相似,該類未知型別質(zhì)粒僅在NDM-體動桿菌屬細(xì)菌中特異性存在.根據(jù) Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)區(qū)的G*量變化推測該區(qū)域外源性的可能性大,攜帶有blaNDM-1 基因的Tn125轉(zhuǎn)座子以大片段水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)入質(zhì)粒.通過比對Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)序列在不動桿菌屬與腸桿菌科細(xì)菌間的差異,我們推測blaNDM-1基因是從其他未知高GO種經(jīng)由不動桿菌屬細(xì)菌進(jìn)入腸桿菌科細(xì) 菌中的進(jìn)化順序.本局部研究可以得出以下幾個結(jié)論：blaNDM-1質(zhì)粒及ISAba125 轉(zhuǎn)座酶是介導(dǎo)bl

10、aNDM-1基因在不動桿菌屬不同菌種間水平轉(zhuǎn)移的重要轉(zhuǎn)座元件； 而不動桿菌屬細(xì)菌是blaNDM-1基因進(jìn)入腸桿菌科細(xì)菌的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié).鑒于國外有關(guān)blaNDM-1基因廣泛存在于腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒上的報道,為了 解blaNDM-1質(zhì)粒在腸桿菌科細(xì)菌與不動桿菌屬細(xì)菌之間序列特征上的差異,探索blaNDM-1基因的跨種屬水平轉(zhuǎn)移機(jī)制,我們對一株來源于弗氏枸檬酸桿菌的 blaNDM-1質(zhì)粒進(jìn)行了研究.通過基因定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)blaNDM-1基因定位于50-78.2kb大小的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上,質(zhì)粒型別IncX3型,全質(zhì)粒GC量49.03%.該blaNDM-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)也由骨架區(qū)(40kb)及可變區(qū)(14kb)兩局

11、部組成.質(zhì)粒 的骨架區(qū)包括了諸如復(fù)制蛋白基因(repB gene)及鞭毛基因(pilX genes)等編碼 質(zhì)粒功能蛋白的基因.blaNDM-1基因定位于可變區(qū),該區(qū)同時含有另一個B -內(nèi)酰胺酶耐藥基因 blaSHV-12,位于blaNDM-1基因下游；可變區(qū)有許多與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的Is元件或 轉(zhuǎn)座子,如 IS26,ISAba125、IS26、IS5、tnpA 和 tnpF ; blaNDM-1 基因上游的 ISAba125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)被I S5轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)插入打斷.通過比對該質(zhì)粒序列與不動桿菌 屬I型Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)兩者均攜帶有與blaNDM-1基因親緣關(guān)系密切的 一簇基因 blaNDM-1-bleo-trpF-ds6C-cutA1-groEL-insE-tnpA,片段大小 8321bp,該區(qū)域的 GC含量為 58%命名為 NCT (NDM-1composite transposon, NDM-1 復(fù)合 轉(zhuǎn)座子區(qū)；而pCFNDM-CNNCT區(qū)以外的區(qū)域與肺炎克雷伯菌 pIncX-SHV質(zhì)粒序列號JN247852很相似覆蓋度96%才目似度99%>因此,我們推測NCT區(qū)是外源性的,是由ISAba125轉(zhuǎn)座酶攜