【實(shí)用文檔】SN0169-92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法

1、出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法受控SN0169-92 代替 ZBX0900- 88I 文件Methodforexaminationofcoliform , fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport1、主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗(yàn)方法.本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗(yàn).2、設(shè)備和材料2.1 吸管：1mL具0.1mL亥1J度；5mL和10mL具1mLJ度.2.2 水浴箱：44.5 ±0.5 Co2.3 培養(yǎng)箱：36±1C, 44.5 ± 0.5 C.2.4

2、冰箱：05c和-15-20 C.2.5 均質(zhì)器.2.6 乳缽和研棒.2.7 平皿：直徑90mm2.8 天平：感量0.1g.2.9 顯微鏡.2.10 稀釋瓶：100mL 200mL和500mL角燒瓶及廣口瓶.2.11 玻璃珠：直徑約5mm2.12 菌落計(jì)數(shù)器.2.13 基及試劑3.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白豚LST肉湯.3.2 煌綠乳糖膽鹽BGLB肉湯.3.3 EC肉湯.3.4 伊紅美藍(lán)瓊脂EMB3.5 營養(yǎng)瓊脂斜面3.6 色氨酸肉湯.3.7 MR-VP培養(yǎng)基.3.8 Korser氏枸椽酸鹽肉湯.3.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA.3.10 Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液.3.11 生理

3、鹽水.3.12 革蘭氏染色液.3.13 Kovacs氏靛基質(zhì)試劑.3.14 甲基紅指示劑.3.15 Voges-proskauerV-P試齊.4、樣品制備4.1 以無菌操作取有代表性的樣品.如有包裝那么用75%乙醇在開口處擦拭后取樣.假設(shè) 不能及時(shí)檢驗(yàn),應(yīng)將冷凍樣品置于-15 C保存；非冷凍而易腐的食品,應(yīng)置于4c冰箱保存. 檢驗(yàn)前冷凍樣品可于25c 18h內(nèi)解凍,或在45c以下15min內(nèi)解凍.4.2 不同食品樣品勻液的制備4.2.1 液體食品以滅菌吸管取樣25mLM入裝有225mLffi釋劑的滅菌玻璃瓶瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠,以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次或以機(jī)械振蕩器振搖,制成1:

4、 10的樣品勻液.4.2.2 固體和半固體食品以無菌操作取25g樣品,放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000r/min均質(zhì) 12min,制成1: 10樣品勻液也可用滅菌乳缽研磨的方法代替.4.3 稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì),用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍 遞增的樣品稀釋液,如10-2、10-3、10-4.從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超 過 15min.5、大腸菌群的測(cè)定5.1 大腸菌群MPNfi的測(cè)定5.1.1 對(duì)每個(gè)樣品,選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液.每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白月示LST肉湯,每管接種1mL5.1.2 將接種管置于36

5、7;1C培養(yǎng)48±2h05.1.3 觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,記錄在 24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的 LST肉湯管數(shù).如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣,那么可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者,那么 進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn).5.2 大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)5.2.1 將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm勺接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽BGLB肉湯管中.5.2.2 置BGL的湯管于36±1C培養(yǎng)48±2h.5.2.3 記錄所有BGL的湯管的產(chǎn)氣管數(shù).5.2.4 結(jié)果報(bào)告：按BGL的湯產(chǎn)氣管數(shù),查MPNft 見附錄B補(bǔ)充件報(bào)告每克毫升 樣品中大腸菌群的MPMS.6、糞大腸菌群測(cè)定6.1 用直徑

6、為3mm勺接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中.6.2 將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5 ± 0.5 C水浴箱內(nèi),培養(yǎng)24±2h. 水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面.應(yīng)以為44.5 C產(chǎn)氣陽性的大腸桿菌和44.5 C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽性和陰性對(duì)照.6.3 記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況.產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陽性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群 試驗(yàn)陰性.6.4 結(jié)果報(bào)告：按產(chǎn)氣管數(shù),查 MPNft報(bào)告每克毫升樣品中糞大腸菌群的MPhfio靛基質(zhì)MRVP枸椽酸鹽鑒定型別十十一一典型大腸桿菌一+一一非典型大腸

7、桿菌十+一十典型中間型一+一十非典型中間型一一十+典型產(chǎn)氣腸桿菌十一十+非典型產(chǎn)氣腸桿菌7、大腸桿菌測(cè)定7.1 將6.3條中的E8湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)EMB 平板,36±1C培養(yǎng)24± 2h07.2 檢查平板上有無具黑色中央有光澤或無光澤的典型菌落7.3 如有典型菌落,那么從每個(gè)平板上至少挑取 2個(gè)典型菌落；如無典型菌落,那么從每個(gè)平 板上至少挑取2個(gè)可疑菌落.用接種針接觸菌落中央部位,移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1C 培養(yǎng)1824h.7.4 將斜面培養(yǎng)物移種到以下培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn).7.4.1 色氨酸肉湯：在36±

8、1C培養(yǎng)24士 2h后,力口 Kovacs氏試齊0.20.3mL,上層出現(xiàn) 紅色為靛基質(zhì)陽性反響.7.4.2 MR-VP培養(yǎng)基：在36±1C培養(yǎng)48±2h.以無菌操作移取培養(yǎng)物 1mL至13mme 100mm 試管中,力口 5% a-茶酚乙醇溶液0.6mL, 40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶,振搖 試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色,為VP試驗(yàn)陽性.將MR-VPS養(yǎng)物的剩余局部再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液.如培養(yǎng)物變紅色,為甲 基紅試驗(yàn)陽性,假設(shè)變黃色那么為陰性反響.7.4.3 Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36土 1c培養(yǎng)96h記錄有無生長.7.4.4 LST肉湯：于

9、36± 1C培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣.7.4.5 革蘭氏染色：取18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色.大腸桿菌為革蘭氏陰性.7.4.6 大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：如出現(xiàn)上表以外的生化反響類型,說明培養(yǎng)物可能不純,應(yīng)重新劃線別離,必要時(shí)做 重復(fù)試驗(yàn).7.5 結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽抱桿菌,發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,IMViC試驗(yàn)為 或I ,再根據(jù) LST肉湯陽性管數(shù)查MPNBl,報(bào)告每克量開樣品中大腸 桿菌MPNfi.8、大腸菌群固體培養(yǎng)基測(cè)定法8.1 樣品制備同第4章.8.2 計(jì)數(shù)8.2.1 選取適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液,每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)滅菌平皿,

10、每皿1mLi另取1mL稀釋劑參加一個(gè)滅菌平皿中,作空白對(duì)照.8.2.2 將冷至45±0.5 C的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA10- 15mL傾注于每個(gè)平皿中.小 心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻.8.2.3 待瓊脂凝固后,再加34mLVRBA蓋平板表層.8.2.4 翻轉(zhuǎn)平板,置于36± 1C培養(yǎng)1824h.8.2.5 選用有30150個(gè)菌落的平板,計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落.典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán).菌落直徑為0.5mm或更大.8.2.6 證實(shí)8.2.6.1 從VRBAT板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,移種于BGL的湯管內(nèi),36±

11、;1C培養(yǎng)24h和48h,觀察產(chǎn)氣情況.8.2.6.2 將出現(xiàn)產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽性.對(duì)形成菌膜的陽性管,應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色,以便排除革蘭氏陽性桿菌.8.2.7 結(jié)果報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為陽性產(chǎn)氣,革蘭氏陰性桿菌的試管百分比乘以于8.2.5條中計(jì)數(shù)的平 板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每克毫升樣品中大腸菌群數(shù).例：10-4樣品稀釋液1mL在VRBAT板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGL的湯管,證實(shí)有6個(gè)陽性管,那么該樣品的大腸菌群數(shù)為：100X 6/10 X 10-4/gmL =6.0 乂 105/gmL附 錄A培養(yǎng)基和試劑補(bǔ)充件A1月桂基硫酸鹽胰蛋白陳LST肉湯胰蛋白月東或胰酪

12、陳Trypticase20g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀2.75g磷酸二氫鉀2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水中.分裝到有倒立發(fā)酵管的20mme 150mnM管中,每管10mLi121c高壓滅菌 15min.最終 pH6.8±0.2.A2煌綠乳糖膽鹽BGAB肉湯蛋白陳10.0g乳糖10.0g牛膽粉oxgall 或 oxbile溶液 200.0mL13.3mL0.1 %煌綠水溶液蒸儲(chǔ)水將蛋白凍乳糖溶于約500mL蒸儲(chǔ)水中,力口入牛膽粉溶液200mL將20.0g脫水牛膽粉溶 于200mL蒸儲(chǔ)水中,pH7.07.5,用蒸儲(chǔ)水稀釋到975mL調(diào)p

13、H7.4.再參加0.1 %煌綠 水溶液13.3mL,用蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足到1000mL用棉花過濾后,分裝到20mme 150mnM管管內(nèi) 有倒立的小發(fā)酵管中,每管10mL 121c高壓滅菌15min.最終pH7.2±0.1.A3E0湯胰蛋白陳或胰酪陳20.0g3號(hào)膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g磷酸氫二鉀4.0g磷酸二氫鉀1.5g氯化鈉5.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲(chǔ)水中,分裝 16mme 150mn«管管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管,每管 8mL 121c高壓滅菌 15min,最終 pH6.9±0.1.A4伊紅美藍(lán)瓊脂EMB10.0g蛋白陳乳糖10.0g磷酸氫

14、二鉀2.0g瓊脂伊紅丫 水溶性0.4g或2%水溶液20mL15.0g0.065g 或 0.5 %水溶液 13mL蒸儲(chǔ)水1000.0mL在1000mLB儲(chǔ)水中煮沸溶解蛋白凍、磷酸鹽和瓊脂,加水補(bǔ)足至原量.分裝于三角燒 瓶中.每瓶100mm 200mL高壓滅菌15min.最終pH7.1±0.2.使用前將瓊脂融化,于 每100m冰脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅丫水溶液和1.3mL0.5%的 美藍(lán)水溶液,搖勻,冷至 4550c傾注平皿.A5營養(yǎng)瓊脂斜面3.0g牛肉膏蛋白陳5.0g瓊脂15.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分加于蒸儲(chǔ)水中,煮沸溶解.分裝適宜的試管.121c

15、高壓滅菌15min.最終pH7.3 ±0.1.滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?A6色氨酸肉湯胰陳或胰酪陳10.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL加熱攪拌溶解胰凍或胰酪陳于蒸儲(chǔ)水中.分裝試管,每管 5mL 121c高壓滅菌15min 最終 pH6.9±0.2.A7MR-V解養(yǎng)基陳陳7.0g葡萄糖磷酸氫二鉀(K2HPQ蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分溶于蒸儲(chǔ)水中,分裝試管,A8Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫錢鈉(NaNHHPO 4HO)磷酸氫二鉀(K2HP(4)1.0g硫酸鎂(MgSO - 7HO)枸椽酸鈉(含2HO)蒸儲(chǔ)水1000.0mL5.0g5.0g121c高壓滅菌 15min,最終 pH6.

16、9±0.2.1.5g0.2g將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水中,分裝試管,每管 ±0.2 .10mL 121c 高壓滅菌 15min.最終 pH6.73.0gA9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)蛋白陳7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂1518g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將上述成分溶于蒸儲(chǔ)水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢?調(diào)至 pH7.4±0.1 o煮沸2min,將 培養(yǎng)基冷至4550c傾注平板.臨用時(shí)制備,不得超過 3h0A10Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀KH2P034.0g蒸儲(chǔ)水5

17、00mL將磷酸二氫鉀溶于蒸儲(chǔ)水中,用1mol/L氫氧化鈉約175mL調(diào)至pH7.2.用蒸儲(chǔ)水加至 1000mLe存于冰箱.稀釋液取貯存液1.25mL,用蒸儲(chǔ)水稀釋至1000mL分裝于適宜容器后,121c高壓滅菌15min.A11生理鹽水氯化鈉 8.5g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將氯化鈉溶于蒸儲(chǔ)水中,121c高壓滅菌15min.A12革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 1.0g95% 乙醇 20.0mL1 %草酸錢水溶液80.0mL將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中,然后與草酸錢溶液混合.革蘭氏碘液：碘 1.0g碘化鉀 2.0g蒸儲(chǔ)水300.0mL將碘與碘化鉀先行混合,參加蒸儲(chǔ)水少許充分振搖,待完全溶解后,再加

18、蒸儲(chǔ)水至 300mL沙黃復(fù)染液：沙黃 0.25g95% 乙醇 10.0mL蒸儲(chǔ)水90.0mL將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸儲(chǔ)水稀釋.染色法a.將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1min,水洗.b.滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗.c.滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗.d.滴加復(fù)染液,復(fù)染1min,水洗、待干、鏡檢.結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色,革蘭 氏陰性菌呈紅色.A13Kovacs氏靛基質(zhì)試劑對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g戊醇75.0mL鹽酸濃25.0mL將對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢參加濃鹽酸即可.A14甲基紅指示劑甲基紅0.1g95% 乙醇 300mL將甲基紅溶解于300mz醇中,加水稀釋至500mLA15Voges-Proskauer(V-P)試劑甲液a-蔡酚5.0g無水乙醇100.0mL乙液氫氧化鉀40.0g用蒸儲(chǔ)水加至100.0mL附 錄B1g檢樣中最近似值(MPN/陽性管教陽性管教0.10.010.0010.10.010.001000<32009.10013201140026202200039203260103210150116.1211200129.22122702312213340206.2220210219.322128022