雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)名稱：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)：熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中 能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為 Photinus pyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光 的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸 腺苷（ATP）。沒有熒光素酶的情況下，螢光素與氧氣反應(yīng)的速率非 常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M(jìn)一步加速反應(yīng)（與肌肉收縮的情況相似）。雙報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測，通常一個(gè) 報(bào)告基因作為內(nèi)對照，使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測均一化。檢測基因表 達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)

2、細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基 因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，比 如，培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。理想的雙報(bào)告基因方法應(yīng)該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具 有的速度，靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因同時(shí)測定。這在傳統(tǒng)的報(bào)告基因，如CAT, B -Gal和GUS是不可能的，由于它們 測試化

3、學(xué)，處理要求所固 有的局限。相反，結(jié)合螢火蟲(Photinus pyralis )和海洋腔腸(Renilla reniformis )雙熒光素酶的系統(tǒng)可滿足 這些要求，在單管中完成這些測試。實(shí)驗(yàn)原理：將目的基因3' UTR區(qū)域或者lncRNA序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基 因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過 比較過表達(dá)或者干擾 miRNA后，檢測報(bào)告基因表達(dá)的改變(以螢火 蟲熒光素酶為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因)可以定量反映 miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定 miRNA與靶基因3' UTR的作用位點(diǎn)。從這兩個(gè)圖譜中

4、可以發(fā)現(xiàn)，ppGL3-Basic這個(gè)載體主要是用于評 估m(xù)iRNA與靶基因3' UTR的結(jié)合，靶基因的3' UTR放在熒光素 酶的后面，這個(gè)熒光素酶是熒火蟲熒光素酶， 而pRL-TK這個(gè)載體則 表達(dá)海腎熒光素酶，將這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞中來檢測熒 光時(shí)，pRL-TK這個(gè)質(zhì)粒起到一個(gè)內(nèi)參的作用。3、pmir-GLO將熒火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶構(gòu)建到一個(gè)載體 上，偏差更小且單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染更簡單。該質(zhì)粒也是由 promega公司開發(fā)的，圖譜如下所示：螢光素酶是理想的報(bào)告基因， 因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成 功能性的螢光素酶，同時(shí)在

5、所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有 最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報(bào)告基因被廣泛用于 miRNA靶基因驗(yàn)證。熒光素酶報(bào)告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3' UTR起作用，可以將目的基因3' UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic 載體中報(bào)告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至 細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾 miRNA后，檢測報(bào)告基因表達(dá)的 改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3'UTR的作用位點(diǎn)。同時(shí)，為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)

6、胞的數(shù)目、細(xì) 胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質(zhì)粒（phRL-TK ）作為對照質(zhì)粒與報(bào)告基因 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件 變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑LuciferaseAssay Reage nt II時(shí)產(chǎn)生螢火蟲熒光信號(hào)，這樣先測量螢火蟲熒光素酶 活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&GloReage nt試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn) 行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。實(shí)驗(yàn)檢測步驟：一、樣品準(zhǔn)備：1質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)染細(xì)胞（1）細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。(2) 轉(zhuǎn)染:16h左右細(xì)胞約70%時(shí)轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒， 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。首先設(shè)計(jì)四組：1. 空白組(轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞)2. 質(zhì)粒組3. 質(zhì)粒 +miRNA NC 組4. 質(zhì)粒 +miRNA mimics 組2.1配制質(zhì)粒組：按照每空50ng質(zhì)粒，同時(shí)每孔20ul無血清培 養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為A。2.2 配制 miRNA NC/mimics : miRNA NC/mimics 的終濃度為 20nM， 同時(shí)每孔20ul無血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，分別標(biāo)記為B、C。2.3配制對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑：按照每孔0.5 si L轉(zhuǎn)染試

8、劑，同時(shí)每孔20ul 無血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為D。2.3稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。2.4將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNA mimics分別和對應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑 混勻，常溫孵育20min。2.5將2.4步驟中試劑對應(yīng)加入孔中。2.6轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。2雙報(bào)告基因檢測(1)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100i L 1XPBS清 洗細(xì)胞。(2)傾斜12孔板，吸干剩余的PBS(3) 去離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB (現(xiàn)配現(xiàn)用)， 使用前放到常溫。(4) 每孔加50卩L稀釋好的1X PLB，置搖床振搖20-30min以 保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。(5) 選用白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液 10 1 L, 加入 100 1 L 預(yù)先混好的 Luciferase Assay Reage nt II, 2s 后 測數(shù)據(jù)，檢測熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。注意此步需在避光條件下進(jìn)行。(6) 測定結(jié)束后，每孔添加1001 L預(yù)先混好的Stop&Glo Reage nt, 靜止2s后，測數(shù)據(jù)，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。(7) 記錄讀數(shù)：每個(gè)樣品會(huì)有3個(gè)數(shù)值：RLU1 螢火蟲熒光素 酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2 內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，計(jì)算兩組數(shù)據(jù)比值， 即 RLU1/RLU2。(8) 分析數(shù)據(jù)：比較1、2組可以