微生物檢查法2612

1、2.6.12非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)1. 簡介： 該法所描述的是在需氧條件下生長的嗜溫性細(xì)菌和真菌類微生物的定量檢測。 設(shè)計(jì)該試驗(yàn)的最初目的是為了確定一種物質(zhì)或制劑是否符合微生物質(zhì)量的既定標(biāo)準(zhǔn)。如果是這種目的，則需要遵從下面的說明，包括所需樣品數(shù)，從而根據(jù)下面所提到的方法來進(jìn)行結(jié)果解釋。 該法不適用于包含微生物作為活性成分的產(chǎn)品。 如果與藥典的等效性作了相關(guān)說明，可以使用自動(dòng)收集法作為替代法。 2. 一般步驟 設(shè)計(jì)方法時(shí)所用條件要避免外在微生物對(duì)待測產(chǎn)品的污染。必須釆取措施，使其不影響任何待測微生物。 如果待測產(chǎn)品有抗菌活性，必須將這種活性去除或中和掉。如果因此使用了滅活劑，

2、必須證明它們對(duì)微生物的高效性和無毒性。 如果在樣品制備中加了表面活性劑，必須證明它們對(duì)微生物的無毒性和與滅活劑的兼容性。 3. 計(jì)數(shù)方法 按規(guī)定用微孔濾膜法或平板計(jì)數(shù)法。MPN法對(duì)微生物測定來說是最不精確的方法，但如果某些產(chǎn)品所含微生物的量極少，則該法是最合適的。 方法選擇基于下列因素：如產(chǎn)品的特性和所要求的微生物限量。所選方法必須能夠測定充足的樣品從而來判斷其是否符合標(biāo)準(zhǔn)。所選方法的適用性必須建立。 4. 促生長實(shí)驗(yàn)、計(jì)數(shù)法的適用性和陰性對(duì)照 4-1 總則 該試驗(yàn)檢測產(chǎn)品中微生物的檢測能力必須被驗(yàn)證。 如果測試條件改變或產(chǎn)品改變，必須證實(shí)方法的適適用性，因?yàn)檫@些改變可能影響試驗(yàn)的最終結(jié)果。4

3、-2 試驗(yàn)菌株的準(zhǔn)備 使用測試菌株標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定的懸浮液或按下面方法制備。使用批菌種培養(yǎng)技術(shù)（seed-lot systems）使得用于接種的微生物從最初的主批種子傳代不多于5次。細(xì)菌和真菌試驗(yàn)株的生長分別見表2.6.12-2。 使用氯化鈉蛋白胨（pH 7.0）緩沖液或pH 7.2的磷酸緩沖液制作試驗(yàn)用懸浮液。對(duì)于黑曲霉菌需要加入0.05聚山梨醇酯80到緩沖液中。在兩小時(shí)內(nèi)使用該菌懸液或2-8下可保存24小時(shí)。作為一種可替代的制備方法，稀釋含有黑曲霉菌或枯草芽孢桿菌的新鮮懸浮液，該懸浮液中加有營養(yǎng)細(xì)胞，從而可以制得一種穩(wěn)定的孢子懸浮液，對(duì)于接種試驗(yàn)來說需要將該孢子懸浮液調(diào)整到一個(gè)合適的體積下。該孢子

4、懸浮液可以在2-8保存至已經(jīng)驗(yàn)證的期限。 4-3 陰性對(duì)照 為了驗(yàn)證試驗(yàn)條件，必須使用特定的稀釋液作為陰性對(duì)照來替代測試液。在該陰性對(duì)照品中必須沒有微生物生長。 按“5”項(xiàng)的方法檢測樣品時(shí)，同樣需要對(duì)照組。如果陰性對(duì)照試驗(yàn)失敗的話需要分析原因。 4-4 促生長培養(yǎng)基 測試每一批準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基，每一批培養(yǎng)基，要么為脫水培養(yǎng)基要么含有所述成分。 用表2.6.12-1中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到含有大豆蛋白胨消化肉湯的液體/平板和大豆蛋白胨消化瓊脂上，對(duì)每一種使用各自的含有培養(yǎng)基的液體/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到沙氏葡萄糖瓊脂平板，

5、對(duì)每一種微生物使用含各自培養(yǎng)基的平板。接種條件見表2.6.12-1。 對(duì)固體培養(yǎng)基而言，以標(biāo)準(zhǔn)接種物來說，所得的生長值不超過計(jì)算值的兩倍。與用先前的測試方法和驗(yàn)證的批培養(yǎng)基所得的測試結(jié)果相比，新制備的接種物將會(huì)出現(xiàn)微生物的生長值。與用先前的測試方法和驗(yàn)證的批培養(yǎng)基所得的測試結(jié)果相比，如果微生物生長清淅可見，則液體培養(yǎng)基是合適的。表2.6.12-1微生物制備和使用微生物受試菌株制備促生長在產(chǎn)品存在的情況下的計(jì)數(shù)方法的適應(yīng)性需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)金黃色葡萄球菌如： ATCC6538 NCIMB9518 CIP4.83 NBRC13276 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆

6、消化肉湯 30-35 18-24小時(shí) 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天銅綠假單胞菌如： ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯 30-35 18-24小時(shí) 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天枯草桿菌 如： ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134

7、酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯 30-35 18-24小時(shí) 酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉 湯 100CFU 30-35 3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯 100CFU 30-35 3天白色念珠菌 如： ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯 20-25 2-3天 酪蛋白大豆消化瓊脂 100CFU 30-35 5天沙氏葡萄糖瓊脂 100CFU 20-25 5天 酪蛋白大豆消化 瓊脂 100CFU 30-35 5天 MPN： 不能適用沙氏葡萄糖 瓊脂 100CFU 20-25 5天 黑曲霉菌 如：

8、 ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡糖萄糖瓊脂 20-25 5-7天或能達(dá)到有很好的芽孢形成 酪蛋白大豆消化瓊脂 100CFU 30-35 5天沙氏葡萄糖瓊脂 100CFU 20-25 5天 酪蛋白大豆消化 瓊脂 100CFU 30-35 5天 MPN： 不能適用沙氏葡萄糖 瓊脂 100CFU 20-25 5天 4-5對(duì)于待測產(chǎn)品合適的計(jì)數(shù)方法 4-5-1 樣品制備 ：樣品制備方法選擇依賴于待測產(chǎn)品的物理特性。如果下述方法均不合適的話，可選用替代方法。水溶性產(chǎn)品：溶解或稀釋（通常1：10的稀釋液）待測產(chǎn)品于氯化鈉蛋白胨（

9、pH 7.0）緩沖液, pH7.2 的磷酸緩沖液或酪蛋白大豆消化肉湯。如有必要，調(diào)節(jié)pH 6-8。如果必要可用相同稀釋液進(jìn)一步稀釋。 不溶于水的非脂類產(chǎn)品：使待測物（通常以1：10稀釋制備）懸浮在pH7.0 的緩沖氯化鈉蛋白胨 溶液，pH7.2 的磷酸緩沖液或酪蛋白大豆消化肉湯中。加入如1g/l的聚山梨醇酯80表面活性劑使幾乎能潤濕的物質(zhì)懸浮。如有需要，調(diào)節(jié)pH為6-8。如果必要可用相同稀釋液進(jìn)一步稀釋 脂類產(chǎn)品：將受檢產(chǎn)品溶解在豆蔻酸異丙脂中，通過過濾或把產(chǎn)品與最小需要量的無菌聚山梨醇 酯80或與其他的非抑制表面活性劑混合進(jìn)行滅菌，如果需要，加熱到不超過40，或者在特殊情況下不超過45。仔細(xì)

10、混合且如有必要在水浴中保溫。加足量預(yù)熱的所選稀釋液來制備原產(chǎn)品的1：10的稀釋溶液。仔細(xì)混合同時(shí)在所需的最短時(shí)間內(nèi)保溫來形成乳狀液?？梢允褂煤泻线m濃度的無菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制無菌表面活性劑來制備一系列的十倍稀釋液。 液體或固體的氣溶膠：將產(chǎn)品在無菌條件下轉(zhuǎn)移到一個(gè)膜過濾裝置或者一個(gè)無菌容器中來進(jìn)一步 取樣。或使用總含量或使用每個(gè)容器劑量確定的量。 透皮貼劑。去掉透皮貼劑的保護(hù)層(“隔離襯墊”)并把它們向上貼在無菌玻璃或塑料盤上。 用無菌多孔物質(zhì)例如無菌紗布來覆蓋粘貼面，避免透皮貼劑粘在一起并把透皮貼劑轉(zhuǎn)移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的滅活劑的所選適當(dāng)體積的稀釋液中。至少用力振

11、搖制備溶液30分鐘。 4-5-2 接種和稀釋：加上述制備的樣品（4-5-1）到一個(gè)控制的（不含待測物質(zhì)）足夠量的微生物混懸溶液中來獲得一個(gè)不超過100CFU的接種液。接種液的體積不能超過稀釋產(chǎn)品的體積的1%。 為說明產(chǎn)品的可接受微生物回收率，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該使用制備樣品的最低可能稀釋因子。如果因?yàn)榭刮⑸锘钚曰蛘卟畹娜芙庑远豢赡茏龅?，需要進(jìn)一步探索合適的方案。如果樣品的生長抑制不可避免，在中和、稀釋或過濾后可加入微生物混懸液。 4-5-3 中和/去除抗微生物活性 把根據(jù)4-5-2所述稀釋制備的樣品和按照4-5-4中所述步驟培養(yǎng)的微生物數(shù)和與對(duì)照制備中回收的微生物數(shù)作比較。 如果生長被抑制（抑制因子

12、大于2），修改計(jì)數(shù)測試的方法來保證結(jié)果的有效性。修改可能包括，如，（1） 稀釋液或培養(yǎng)基體積的增加，（2）特殊的或一般的中和劑與稀釋液的結(jié)合，（3）膜過濾，或（4） 上述措施的組合。 中和劑： 中和劑可被用來中和抗菌劑的活性（表2.6.12.-2）?？稍跍缇凹尤氲剿x稀釋液或更 好的培養(yǎng)基中。如果使用的話，它們的功效和對(duì)微生物無毒性必須通過使用中和劑而不使用產(chǎn)品的空白實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說明。 干擾物質(zhì) 可能的中和方法戊二醛，汞硫酸氫鈉（亞硫酸氫鈉）酚，醇，醛，山梨酸酯稀釋乙醛甘氨酸季銨化合物(QACs)，對(duì)羥基苯甲酸酯（對(duì)羥基 苯甲酸酯），二-二雙胍類卵磷脂QACs， 碘，對(duì)羥基苯甲酸酯聚山梨醇酯汞劑

13、硫乙醇酸鹽汞劑，鹵素，醛硫代硫酸鹽EDTA（乙二胺四乙酸鹽）Mg2+或Ca2+若沒有合適的中和方法，可認(rèn)為分離接種微生物失敗歸因于產(chǎn)品自身的殺菌活性。這說明產(chǎn)品不可能被上述微生物污染。然而，產(chǎn)品可能只對(duì)其中一些有抑制作用，而對(duì)其他一些測試菌株沒有作用或菌株沒有代表性。然后，以微生物生長和標(biāo)準(zhǔn)所允許的最高濃度系數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)。 4-5-4. 產(chǎn)品存在情況下微生物的回收率 對(duì)以上列出的微生物進(jìn)行單獨(dú)的試驗(yàn)。僅對(duì)加入的測試菌微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。 4-5-4-1. 膜過濾： 使用孔徑不大于0.45m的濾膜過濾。選擇濾膜材料類型時(shí)，要求濾膜對(duì)微生物的滯留能力不受到待測樣品成份的影響。每種上述微生物使用一張濾膜。

14、 將適量按4-5-1至4-5-3制備的樣品（含1g產(chǎn)品，若預(yù)期CFU較大，則小于1g）用膜過濾，立即過濾并用適量稀釋液沖洗濾膜。 將膜轉(zhuǎn)移到酪蛋白大豆消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌數(shù)（TYMC）。按表2.6.12-2接種，進(jìn)行計(jì)數(shù)。 4-5-4-2. 平板計(jì)數(shù)法：至少在對(duì)各培養(yǎng)基使用兩次平板計(jì)數(shù)法，對(duì)結(jié)果取平均值。 4-5-4-2-1. 傾注培養(yǎng)法 在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，加入1ml按4-5-1至4-5-3法制備的樣品以及15-20ml酪蛋白大豆消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂。培養(yǎng)基溫度均不超過45。若使用更大的培養(yǎng)皿，則瓊脂的量也要相應(yīng)

15、增加。對(duì)于表2.6.12.-2中列出的每種微生物，至少要使用2個(gè)培養(yǎng)皿。根據(jù)表2.6.12.-2進(jìn)行培養(yǎng)。取各培養(yǎng)基的菌落數(shù)的算術(shù)平均值計(jì)算原接種物的CFU。 4-5-4-2-2. 表面涂布法 在各直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入15-20ml酪氨酸大豆消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂，放置使其凝固。培養(yǎng)基溫度均不超過45。若使用更大的培養(yǎng)皿，則瓊脂的量也要相應(yīng)增加。在層流通風(fēng)柜或培養(yǎng)箱中干燥。對(duì)于表2.6.12.-2中列出的每種微生物，至少要使用2個(gè)培養(yǎng)皿。量取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3制備的樣品涂布于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)并按4-5-4-2-1描述的方法計(jì)數(shù)。 4-5-4-3最大概率數(shù)法（MPN）

16、MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及膜過濾法和平板計(jì)數(shù)法。對(duì)霉菌計(jì)數(shù)的結(jié)果尤為不可靠。因此，在其他方法不可行時(shí)，才可以考慮使用MPN法對(duì)TAMC計(jì)數(shù)。如果認(rèn)定該法可用，則按以下方法進(jìn)行。 按4-5-1至4-5-3制備至少3個(gè)系列10倍產(chǎn)品稀釋液。對(duì)于每個(gè)濃度梯度的溶液，將3等分試樣接種于含9-10ml酪蛋白大豆消化培養(yǎng)基的試管內(nèi)。若有必要，應(yīng)向培養(yǎng)基中加入表面活性試劑，例如山梨酸酯80，或微生物抑制劑。這樣，若使用3個(gè)梯度的稀釋度，則共接種9個(gè)試管。 在30-35培養(yǎng)不超過3天。若因產(chǎn)品本身的性質(zhì)難以讀出結(jié)果或不能確定，則在同一培養(yǎng)基或酪蛋白大豆消化瓊脂上在同一溫度下傳代培養(yǎng)1-2天，得到的結(jié)果。根據(jù)

17、表2.6.12.-4確定每克或每毫升產(chǎn)品微生物最大概率數(shù)。 4-6. 結(jié)果和解釋 在確定膜過濾法和平板計(jì)數(shù)法的適用性時(shí)，任意試驗(yàn)菌平均數(shù)與4-5-2中無產(chǎn)品存在的對(duì)照值相差不大于2。在確定MPN法適用性時(shí)，接種值的計(jì)算值與對(duì)照值必須在95置信區(qū)間內(nèi)。 若不符合上述標(biāo)準(zhǔn)或試驗(yàn)菌大于以上方法所述，則使用最接近標(biāo)準(zhǔn)的方法和試驗(yàn)條件。 5. 產(chǎn)品試驗(yàn) 5-1.試驗(yàn)使用量 除另有規(guī)定外，參照上述方法取10g或10ml待測品。液體或固體的氣溶膠，取10個(gè)容器的樣品。若為透皮貼劑，取10片。 活性物質(zhì)按以下方式制備的情況下，試驗(yàn)用量可以減少：單位劑量（如片劑，膠囊和注射劑）少于或等于1mg，或每克或每毫升（

18、對(duì)于不以單位劑量為形式的制劑）中活性物質(zhì)少于1mg。在這些情況下，試驗(yàn)用量不少于產(chǎn)品的10個(gè)單位劑量或10g或10ml。 對(duì)于作為活性物質(zhì)的原料，若樣品的量受限制，或批量很?。ㄈ纾荷儆?000ml或1000g），則試驗(yàn)量應(yīng)為批量的1，除非另有規(guī)定允許使用更小的量。 對(duì)于批量總數(shù)小于200（如臨床試驗(yàn)使用的樣品），則樣品可減少為2個(gè)單位，若批量小于100，可為1個(gè)單位。 從原料藥或包裝的制劑中隨機(jī)取樣?；旌弦欢堪b中的產(chǎn)品，以便得到足量樣品。5-2. 產(chǎn)品試驗(yàn) 5-2-1. 膜過濾 使用規(guī)定的過濾裝置過濾培養(yǎng)基。根據(jù)第4節(jié)中所述適用的方法制備樣品，并將適量樣品各轉(zhuǎn)移到2張膜上，并立即過濾。選取

19、以下合適的方法沖洗各膜。 將膜轉(zhuǎn)移到酪蛋白大豆消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌（TYMC）。接種于酪蛋白大豆消化瓊脂上，在30-35下培養(yǎng)3-5天，接種于沙氏葡糖瓊脂上，在20-25下培養(yǎng)5-7天。計(jì)算每克或每毫升產(chǎn)品的CFU。 對(duì)于透皮貼劑，根據(jù)4-5-1所述，各通過2張無菌膜分別過濾制劑體積的10。將一張膜轉(zhuǎn)移至酪蛋白大豆消化瓊脂上確定TAMC，另一張轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上確定TYMC。 5-2-2.平板計(jì)數(shù)法 5-2-2-1. 傾注培養(yǎng)法 根據(jù)第4節(jié)所述制備樣品。每一培養(yǎng)基的每種稀釋度至少制備2個(gè)培養(yǎng)皿。接種于酪蛋白大豆消化瓊脂

20、上的，在30-35下培養(yǎng)3-5天；接種于沙氏葡糖瓊脂上的，在20-25下 培養(yǎng)5-7天。根據(jù)上述稀釋度選取相應(yīng)培養(yǎng)皿， TAMC的最大菌落數(shù)不少于250個(gè)，TYMC最大菌落數(shù)不少于50個(gè)。取各培養(yǎng)基的菌落數(shù)的算術(shù)平均值，計(jì)算每克或每毫升產(chǎn)品的CFU。 觀察到的各試管菌數(shù)每克或每毫升產(chǎn)品的MPN95%置信區(qū)間各試管種產(chǎn)品的克數(shù)或毫升數(shù)0.10.010.001000< 30-9.400130.1-9.501030.1-100116.11.2-170206.21.2-170309.43.5-351003.60.2-171017.21.2-17102114-351107.41.3-20111114-35120114-35121155-38130165-382009.21.5-35201144-35202205-38210154-38211205-38212279-94220215-40221289-94222359-94230299-94231369-94300235-94301389-1043026416-18