菠蘿蛋白酶的制備及活性測(cè)定

1、菠蘿蛋白酶的制備及活性測(cè)定背景菠蘿蛋白酶 (Bromelain)，別名菠蘿酶， 是存在于菠蘿 (Anana COmOSl2S)植株中的蛋白質(zhì)水解酶， 為淺黃色無(wú)定形粉末， 微有異臭。 菠蘿的果、 莖、柄和葉片中都含有菠蘿蛋白酶。一般從菠蘿果中提取的稱為果菠蘿蛋白酶，從菠蘿皮、 莖中提取的為莖菠蘿蛋白酶。八成熟的菠蘿果汁含有約0 4 的菠蘿蛋白酶，成熟的菠蘿果汁含有O3 左右的菠蘿蛋白酶，莖汁含 8 7 的菠蘿蛋白酶 (Murachi ，et a1 ， 1964) 。 1981 年， Marcano首先發(fā)現(xiàn)菠蘿汁中含有蛋白水解酶，隨后Willstatter， Bergmann和 Martin相繼

2、指出，菠蘿蛋白酶存在于果、 皮和莖部中， 存在于莖部的稱為莖酶 (Stembromelain EC3 4 22 4) ，存在于果汁中的酶稱為果酶(Fruit bromelainEC3 4 22 5) 。Murachi和 Neurath、E1 G harbawi和 Whitaker采取層析法分離提取了菠蘿蛋白酶并研究了它的活性成分。結(jié)構(gòu)特性研究表明，果菠蘿蛋白酶是酸性酶，等電點(diǎn)為pH4 6 ，莖菠，約為33 ，000 ，等電點(diǎn)為 pH9 5 ，其活性中心的氨基酸順序和催化機(jī)理與木瓜蛋白酶相似，并確定莖菠蘿蛋白酶為糖蛋白。Ota S et aL研究指出，莖菠蘿酶分子量為36000，末端氨基酸殘基是

3、丙氨酸，果酶分子量為30000，末端氨基酸殘基也為丙氨酸，碳水化合物分析與Muraclli的分析結(jié)果相似。1988年， T L邁諾特等由十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠電泳(SDS PAGE) 測(cè)定果菠蘿蛋白酶分子量22200 25080 ，等電點(diǎn) 3 84 8 。菠蘿蛋白酶是各種酶的混合物，已知菠蘿蛋白酶粗品中包含至少五種蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和過(guò)氧化物酶，并含有淀粉酶和纖維素酶活性，還存在其他成分。菠蘿蛋白酶成分的復(fù)雜性，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，特別是醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)δ艹煞值囊笊?，因此?duì)菠蘿蛋白酶的成分和各成分的具體功能的分析研究具有重要意義。菠蘿蛋白酶純品是一種糖蛋白，分

4、子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)寡糖分子，由木糖(xylose，xyl) 、巖藻糖 (fucose，F(xiàn)uc) 、甘露糖 (mannose，Mall) 和 N 一乙酰葡萄胺(N aceltylglucosamine，GIcNAC)組成用離子交換柱層析、硫酸銨沉淀等方法提純得到的菠蘿蛋白酶進(jìn)行研究表明，菠蘿蛋白酶相對(duì)分子量為33200D，等電點(diǎn)為pH9 55 ，酶液的最大吸收波長(zhǎng)為280nm，0 051 濃度的酶液在280nm的光吸收值達(dá)0 984(Murachi，et a1 ， 1964)。分子中有4 個(gè) N一乙酰化的氨基己糖，含糖2 1 ，分子中有285個(gè)氨基酸殘基，含氮量為15 88 。在 Murachi

5、等研究的基礎(chǔ)上， 1989 年，Ritonja 等排列出了菠蘿蛋白酶主要組分的氨基酸順序，有 20 種氨基酸，共 212 個(gè)， C 端的氨基酸為谷氨酸 (Glu) ，N 端的氨基酸為丙氨酸(Ala) ，相對(duì)分子質(zhì)量為23828 。菠蘿蛋白酶作為有活性的蛋白質(zhì)，易受到溫度、pH 、金屬離子等的影響。 研究表明 ( 章佩芬等， 1999)：菠蘿蛋白酶的最適反應(yīng)溫度介于55 60 ，溫度再高， 酶的熱失活增強(qiáng)， 反應(yīng)速度下降； 菠蘿蛋白酶的最適pH 在 6 5 7 5 ，在 7 1附近達(dá)最大值， 在酸性環(huán)境中，酶反應(yīng)速度下降快，在堿性下有個(gè)較寬的應(yīng)用范圍，酶較穩(wěn)定的 pH 范圍在 3 54 5 ；菠

6、蘿酶反應(yīng)影響不大，MgCl2 、 CaCh 對(duì)酶有一定程度的抑制作用。生產(chǎn)過(guò)程中，為了保護(hù)酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保護(hù)劑，如 EDTA 、維生素 C、半胱氨酸等， 提高酶的活性， 延長(zhǎng)酶的保存時(shí)間。 1999年，HHLiang等人研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚與菠蘿蛋白酶結(jié)合后能提高酶的熱穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的半衰期。1 3 菠蘿蛋白酶的提取純化方法菠蘿蛋白酶的提取純化方法很多，目前，用于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法主要有三種( 王平諸等，2002)：高嶺土吸附法、單寧沉淀法、超濾濃縮法。流程(1) 高嶺土吸附法工藝流程菠蘿下腳料 ( 壓榨 ) 一汁液 ( 高嶺土吸附 ) 一吸附物 ( 洗脫、壓濾 )

7、 一洗脫液 ( 鹽析 ) 一鹽析物 ( 離心) 一濕粗酶餅 ( 溶解、過(guò)濾 ) 一澄清液 ( 沉淀 ) 一濕酶 ( 干燥 ) 一精品(2) 單寧沉淀法工藝流程菠蘿下腳料 ( 壓榨 ) 一汁液 ( 去雜質(zhì) ) 一澄清液 ( 加穩(wěn)定劑 ) 啼穩(wěn)定液 ( 加單寧 ) 一單寧沉淀物 ( 洗脫) 一濾液 ( 干燥 ) 一酶制品(3) 超濾濃縮法工藝流程菠蘿下腳料 ( 壓榨 ) 一汁液 ( 去雜質(zhì) ) 一澄清液 ( 超濾濃縮 ) 一濃縮液 ( 降溫、加沉淀劑、沉淀) 一濕酶 ( 減壓干燥 ) 一酶制品步驟2 4 1 1 酪蛋白溶液的配制稱取酪蛋白0 609 ，加 0 05mol L 磷酸二氫鈉溶液80mL

8、 ，攪拌溶解后，加0 1molL 鹽酸液調(diào)節(jié)pH 至 7 0 ，加水至100mL即得。2 4 1 2 酶稀釋液的配制稱取 L 半胱氨酸0 269 ， EDTA 0 229 ，分別加適量水溶解后，調(diào)節(jié)pH 至 6 0 ，加水定容至100mL，即得本液，現(xiàn)配現(xiàn)用。2 4 1 3 三氯乙酸溶液的配制稱取三氯乙酸17 999 ，加醋酸鈉29 949 ，和冰醋酸18 9mL ，加適量水溶解后，加水至1000mL，搖勻，即得。2 414磷酸緩沖液量取0 2 mol L Na2HP04 溶液 1 2 3mL 與 87 7mL 0 2 mol L NaI-12P04溶液混合，定容至 500ml 即得 0 05

9、mol L， pH6 0 磷酸緩沖液。2 415層析緩沖液稱取1 219 Hs 堿， 0 589 NaCl ， 1 mol L 的 EDTA lmL，加蒸餾水稀釋到 1L ，用磷酸鹽調(diào) pH5 0 8 O。梯度洗脫時(shí)高濃度氯化鈉洗脫液的配制，加氯化鈉87 669 ，至 1 50mol L ，其余數(shù)據(jù)同上。2 4 1 6 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳所用溶液儲(chǔ)存液：2 mol L Tris ·HCI(pH8 8) ， 100mL稱取 2429Tris 堿，加 50mL 蒸餾水， 緩慢加濃鹽酸至pH8 8 ，再加蒸餾水至100mL。l mol L Tris-HCI(pH6 8) ， 100

10、mL稱取 1219 秭 s 堿，加 50mL 蒸餾水， 緩慢加濃鹽酸至pH8 8 ，再加蒸餾水至100mL。10 (W V)SDS ， 100mL稱取 109 SDS，加蒸餾水至100mL，室溫保存。 50 (V 廠 V) 甘油， 100mL倒取甘油 (100 )50mL，加入 50mL蒸餾水。 l (W V) 溴酚藍(lán)， 10mL稱取 100mg溴酚藍(lán)，加蒸餾水至100mL，攪拌至完全溶解，過(guò)濾除去聚合的染料。工作液：A 液：丙烯酰胺儲(chǔ)存液，10mL30 (W V) 丙烯酰胺， O 8 (W ) 雙丙烯酰胺。 B 液： 4X 分離膠緩沖液， 100mL(4 下保存 )75mL 2mol L T

11、ris-HCl(pH8 8) ， 4mL 10 SDS ， 21mL蒸餾水。C 液： 4X堆積膠緩沖液， 100mL(4 下保存 )50mL lmol L Tris HCl(pH6 8) ， 4mL 10 SDS ， 46mL蒸餾水。10 過(guò)硫酸銨， 5mL0 59 過(guò)硫酸銨， 5mL 蒸餾水，密封于磨口試管，4"C 下保存。電泳緩沖液， lL39 Tris 堿， 14 49 甘氨酸， lg SDS ，加蒸餾水配成1L 溶液，室溫下保存。2x 樣品緩沖液， 100mL0 25mol L"Iris-HCl(pH6 8) ，4 (W V)SDS， 20 (V V) 甘油，痕量溴

12、酚藍(lán)，濃縮膠緩沖液 (4X)5mL ，SDS( 干粉 )0 49 ，甘油 (50)4mL，溴酚藍(lán) (1 )201xl，加水至 100mL 。含 2 巰基乙醇的樣品緩沖液(1X)現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋 2X 樣品緩沖液儲(chǔ)液，加入2 巰基乙醇至終濃度為5(V V) 。灌制 x 分離膠的計(jì)算A 液 X 3mL ，·B 液 2 5mL ，蒸餾水 (7 5制 3)mL ，10 過(guò)硫酸銨509L ，TEMED 501 tl(X>8 時(shí)，用 10u 1) 總量 10mL 。2 4 2 酶活測(cè)定方法對(duì)于供試酶液 (2 4 4 1) 量取 5mL( 酶制品稱取樣品0 0159 ，置研缽中，加適量酶稀釋液

13、研磨 10rain) 用水移至 100mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，量取5mL 至 10mL量瓶中，加酶稀釋液至刻度，搖勻，放置 15min后，準(zhǔn)確量取 lmL ，置具塞試管中于 37+024C 水浴中保溫 10min，精密量取在37 ±0 2"C 中保溫的酪蛋白溶液5mL ，迅速加入混勻，同時(shí)開動(dòng)秒表，準(zhǔn)確反應(yīng)10rain，立即加入三氯乙酸溶液5mL ，搖勻，過(guò)濾。另取樣品溶液 lmL 置具塞試管中于37+0 2"C 保溫 10min ，精密加入 37 三氯乙酸溶液 5mL ，準(zhǔn)確反應(yīng) 10rain ，立即精密加入酪蛋白溶液5mL ，搖勻，過(guò)濾，濾液作空白，按照

14、分光光度法 ( 中國(guó)藥典 1977版 ) 在 275nm處測(cè)定吸光度 ( 施特爾馬赫， 1992) 。準(zhǔn)確稱取酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 50mg ，置 100mL量瓶中， 加 O1mol L 鹽酸溶液至刻度， 搖勻，準(zhǔn)確量取 lmL置 10mL 量瓶中，加O 1mol L 鹽酸溶液至刻度，搖勻( 每 lmL 含酪氨酸 5099 ，以水作空白，在 275nm處測(cè)定吸光度。在 pH7 0 ， 37*(2條件下，每分鐘水解酪蛋白生成lpg L 酪氨酸所需的酶量為一個(gè)活力單位。酶活力計(jì)算公式：每克 (mL) 菠蘿蛋白酶活力U g(U mL) =石 A×so× 。11 。 ×意以 10

15、樣品體積(重量)A： 樣品吸光度As ：酪氨酸吸光度11 ：樣品最后反應(yīng)完畢體積10 ：反應(yīng)時(shí)間50 ：每 mL 含有酪氨酸的燼數(shù)2 4 3 蛋含量測(cè)定方法采用考馬斯亮蘭G 250 法 (George R， 1973)測(cè)定蛋白質(zhì)含量：標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：稱取10mg牛血清白蛋白溶于去離子水并定容至100mL，配成0 1mg mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液?？捡R斯亮蘭G 250 染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G 250 ，溶于 50mL 95的乙醇后，再加入120mL 85的磷酸，用水稀釋至lL ，過(guò)濾后貯于棕色瓶中。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取7 支試管，編號(hào)后如表1 ，混勻，放置2min后，在 595nm波長(zhǎng)

16、下比色測(cè)定 ( 應(yīng)在lh內(nèi)完成 ) ，以牛血清白蛋白含量( 嵋 ) 為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)。2 4 4 2 納米 n02吸附法供試酶液中加納米Ti02攪拌均勻一離心 (4000 rpm ， 15min) 一取沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫一攪拌 (30rain)一離心 (4000 rpm， 15rain) 一取上清液一超濾濃縮一冷凍干燥一酶制品。操作要點(diǎn)：吸附、洗脫：供試酶液置于玻璃或不銹鋼容器中，加入納米Ti02 攪拌均勻，吸附20 30min，離心棄上清，沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫，離心取上清。超濾：洗脫液先用截留分子量為40KD的超濾膜除去較大分子量的雜蛋白，再用截留分子量為 20KD的超濾膜除

17、去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質(zhì)，采用加去離子水多次超濾。冷凍干燥：據(jù)共晶點(diǎn)確定干燥參數(shù)。納米 Ti02吸附能力再生： 納米二氧化鈦吸附洗脫后，采用 0 1mol LNaOH溶液浸泡，再用去離子水洗滌至中性，干燥后進(jìn)行重吸附實(shí)驗(yàn)，吸附效果可恢復(fù)90 以上。2443 高嶺土吸附法供試酶液 -an 4高嶺土，攪20min,10。 C 吸附 30 60min-,靜置一吸出上清一沉淀用 16 NaOH 調(diào) pH6 5 7 O 一加 7 9 NaCl ，攪 30min一壓濾，濾液用1 ：3( 體積比 ) 鹽酸調(diào) pH5 O 一攪拌 -an濾液量 25 (NH4) ： S04 一溶解一 4 靜置過(guò)夜一

18、離心一沉淀一干燥( 王平諸等， 2002)。操作要點(diǎn)：吸附：將供試酶液加入吸附槽中攪拌，同時(shí)加入4 的高嶺土，攪拌約 20rain，在10吸附 30 60min，用虹吸排掉上清液，收集高嶺土吸附物。洗脫：用16 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié)吸附物的pH 至 7 0 左右，再加入吸附質(zhì)量為7 9 的工業(yè)食鹽，攪拌30min進(jìn)行洗脫，然后迅速壓濾，收集濾液。鹽析：將壓濾液收集在鹽析槽中，用1 ：3的鹽酸調(diào)節(jié)pH至 5O左右，攪拌加入壓濾液質(zhì)量25 的硫酸銨，待完全溶解后，4"C過(guò)夜：然后離心，收集沉淀鹽析物，干燥即為粗酶。2444超濾濃縮有機(jī)溶劑沉淀提取供試酶液一超濾濃縮一有機(jī)溶劑沉淀一干燥一酶制品。操作要點(diǎn)：超濾：供試酶液先用截留分子量為40KD的超濾膜除去較大分子量的雜蛋白，再用截留分子量為20KD的超濾膜除去較小分子量的雜蛋