放療對食管癌患者血清可溶性MICA含量及外周血NK細(xì)胞功能的影響

1、放療對食管癌患者血清可溶性 MICA含量及外周血NK細(xì)胞功能的影響【摘要】目的探討經(jīng)不同劑量高能X線照射后食管癌患者血清可溶性MHC-I類分子鏈相關(guān)基因A (sMICA)含量、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)表面NK細(xì) 胞2族成員D(NKG2受體的表達(dá)及其殺傷毒性的變化。方法 采用ELISA法檢測中晚期食管癌患者(n=28)和正常對照(n=21)血清sMICA的含量,并動態(tài)分析6例 食管癌患者經(jīng)不同劑量高能X線照射后血清sMICA含量的變化。采用流式細(xì)胞術(shù) 檢測NK細(xì)胞NKG2受體的表達(dá)，胞內(nèi)染色法分析NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能的變化。 結(jié)果與正常對照相比，食管癌患者血清sMICA含量明顯升高，但不同放療

2、劑量對 食管癌患者血清sMICA含量無顯著影響。食管癌患者外周血陽性表達(dá) NKG2D勺 NK細(xì)胞比例與正常對照相比顯著降低，同時(shí)其細(xì)胞毒活性亦明顯降低。 而且與治 療前相比,4060 Gy的放療劑量時(shí)NKG2D日性的NK細(xì)胞數(shù)增加,同時(shí)其NK細(xì)胞 毒活性最強(qiáng)。結(jié)論 放療對食管癌患者血清sMICA含量無明顯影響，但適量放療可 使NK細(xì)胞毒活性增強(qiáng)?！娟P(guān)鍵詞】食管腫瘤;放射治療;MHC-I類分子鏈相關(guān)基因A;自然殺傷細(xì)胞MHC-I 類分子鏈相關(guān)基因 A(MHCClass I chain-related gene A, MICA) 位于HLA-B位點(diǎn)上游約46 kb,其編碼分子結(jié)構(gòu)類似HLA-I類分

3、子，但不與P2微 球蛋白結(jié)合，不遞呈抗原肽。MICA主要表達(dá)于絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì) 胞、受誘導(dǎo)分化藥物處理的細(xì)胞及射線照射引起DNA損傷的細(xì)胞，代表著機(jī)體的一種應(yīng)激反應(yīng)。MICA通過與NK細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞表面的活化性受體NK細(xì)胞2 族成員D(NKG2D相結(jié)合,激活免疫系統(tǒng)而清除腫瘤及其他基因組損傷的細(xì)胞 ,在 抗腫瘤和抗感染中發(fā)揮重要作用。然而研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面的MICA分子可受 到金屬蛋白酶的降解而成為可溶性分子(sMICA),sMICA與NKG2結(jié)合后促進(jìn)了受 體的內(nèi)吞和降解，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的功能。在前列腺癌、腸癌、宮頸癌及頭頸癌 中均顯示血清內(nèi)sMICA含量與患者預(yù)

4、后呈負(fù)相關(guān)。另外,我們的前期研究發(fā)現(xiàn), 放療可促進(jìn)食管癌細(xì)胞株ECA-109表達(dá)MICA分子,但其是否對食管癌患者血清 sMICA的含量產(chǎn)生影響,目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),NKG2D是 NK細(xì)胞表面重要的活化性受體,其表達(dá)量高低可反 映NK細(xì)胞的活性狀態(tài)。在食管癌的放療過程中，放療劑量決定其局部腫瘤控制率， 但過高劑量的照射往往損傷患者的免疫功能。因此本研究探討食管癌患者在接受 放療時(shí)對血清sMICA含量、NKG2D日性表達(dá)的NK細(xì)胞比例及NK細(xì)胞毒功能的影響,從而深入了解食管癌患者放療過程中患者體內(nèi)NK細(xì)胞功能的變化，為進(jìn)研究放療聯(lián)合免疫增強(qiáng)治療提供理論依據(jù)。1材料和方法試劑和藥品ELISA雙

5、抗體夾心法檢測試劑盒,購自德國ImmaticsBiotechnologies公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG,購自深圳晶美 公司。淋巴細(xì)胞分離液購自上海生物工程公司；小牛血清和胎牛血清為杭州四季 青公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基為Invitrogen 公司產(chǎn)品;青霉素、鏈霉素、p巰 基乙醇為上海生物工程公司產(chǎn)品；K562細(xì)胞為本室常規(guī)保存；FITC-CD56單克隆 抗體（mAb）、PE-Cy5-穿孔素 mAb PE-NKG2D mA購自 eBioscienee 公司。分組 正常對照組:21例正常人，男12例,女9例,年齡1862歲。收集 血清5 ml,其中11例同時(shí)收集外周

6、抗凝血5 ml。食管癌組:28例中晚期食管癌 患者（均為食管病灶長度5 cm,未發(fā)現(xiàn)其他的轉(zhuǎn)移灶）,男16例,女12例,年齡 5178 歲。方法直線加速器照射食管癌患者所有食管癌患者予以瓦利安直線加速器6 MV X線進(jìn)行放療。放療后收集血清 5 ml,中25例同時(shí)收集外周抗凝血5 ml。 另外,6例食管癌患者在治療前、治療劑量累計(jì)達(dá) 2030 Gy及40-60 Gy時(shí)均收 集血清5 ml、外周抗凝血5 ml。ELISA法檢測血清sMICA濃度雙抗體夾心法，包被抗體為AMO1檢測抗 體為BAMO3針對MICA分子的a3結(jié)構(gòu)域）,酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體。 取標(biāo)準(zhǔn)品、患者血清、正常對照組血

7、清及PBS各100卩1加入各孔。封蓋后37C 孵育2 h;沖洗3次,用試劑稀釋液將檢測抗體稀釋成終濃度為400卩g/L,各孔加入100卩l(xiāng),封蓋37C孵育2 h;沖洗3次，加酶，沖洗3次，加底物，當(dāng)顯色滿意后 每孔加入終止液（1 mol/L硫酸）50卩1終止反應(yīng)；輕拍使之混勻后立即上機(jī)檢測， 以450 nm讀取光密度值。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品曲線擬合后獲得每份標(biāo)本中sMICA的含量。流式細(xì)胞儀檢測NKG2D勺表達(dá) 取5 ml外周抗凝血,Ficoll常規(guī)分離 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）,分別用PE-NKG2單抗、PE-Cy5-CD56單抗,FACS Aria 流式細(xì)胞儀檢測NKG2D日性表達(dá)的NK細(xì)胞比例。

8、NK細(xì)胞毒活性測定 當(dāng)NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞時(shí)，釋放其細(xì)胞內(nèi)的穿孔素， 胞內(nèi)染色法分析穿孔素陽性 NK細(xì)胞減少的數(shù)量（即釋放穿孔素的NK細(xì)胞）占總 NK細(xì)胞的比例，可代表NK細(xì)胞的殺傷毒性。具體方法為：取外周抗凝血5 ml,Ficoll常規(guī)分離PBMC與對數(shù)期K562細(xì)胞按10 ：1比例37E 5% CO2孵育2h,加入高爾基體阻斷劑 brefield A（BFA, 10 mg/L）,4 h 后按照eBioscienee公 司胞內(nèi)染色法的操作說明標(biāo)記 NK細(xì)胞內(nèi)的穿孔素。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間血清 sMICA含量、 NKG2D日性表達(dá)的NK細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞毒活性的比較

9、均用團(tuán)體t檢驗(yàn)。食管癌患 者不同劑量照射后血清sMICA含量的變化用ANOVAr差分析和q檢驗(yàn)。食管癌患 者經(jīng)不同劑量照射后NKG2D6達(dá)率、NK細(xì)胞功能的變化采用團(tuán)體t檢驗(yàn)。P)。 見表2。表2不同放療劑量對食管癌患者血清 sMICA含量的影響食管癌患者外周血NK細(xì)胞NKG2陽性表達(dá)率及NK細(xì)胞毒功能的變化 利用流式細(xì)胞術(shù)分析食管癌組和正常對照組外周血NK細(xì)胞表達(dá)NKG2的陽性率,結(jié)果顯示食管癌組NKG2D0性率顯著降低(P<),見表3。同時(shí)利用胞內(nèi)染色法分 析NK細(xì)胞接觸K562細(xì)胞時(shí),釋放穿孔素的NK細(xì)胞比例作為評價(jià)NK細(xì)胞殺傷毒 性,比較2組NK細(xì)胞的殺傷毒性,發(fā)現(xiàn)食管癌組NK細(xì)

10、胞毒性明顯降低(PV),見表 4。表3 2組NK細(xì)胞NKG2陽性表達(dá)率的比表4 2組NK細(xì)胞殺傷毒性的比較 4060 Gy的放療劑量時(shí)NKG2陽性表達(dá)率及NK細(xì)胞毒功能的變化對 6例食管癌患者動態(tài)檢測其體內(nèi) NKG2的表達(dá)率及NK細(xì)胞毒功能，分別比較治療 前、2030 Gy和4060 Gy的治療劑量時(shí)NKG2陽性表達(dá)的NK細(xì)胞數(shù),發(fā)現(xiàn)4060 Gy的治療劑量時(shí)NKG2表達(dá)率最高,與治療前相比差異有顯著性(P<),見圖1。與 之對應(yīng)的是，此時(shí)NK細(xì)胞殺傷毒性亦最高,與治療前相比明顯提高(P<),見圖2。3討論我們采用回顧性研究的手段，不僅分析中晚期食管癌患者與正常個(gè)體血 清內(nèi)sMIC

11、A含量、NKG2陽性表達(dá)的NK細(xì)胞數(shù)及NK細(xì)胞毒活性,還觀察了接受 不同放療劑量治療后，患者血清內(nèi)sMICA含量的變化、NKG2啲表達(dá)及NK細(xì)胞功 能變化,從而在整體水平研究高能X線照射對患者體內(nèi)腫瘤抗原表達(dá)及免疫功能 的影響,為在放射治療過程中及時(shí)監(jiān)測患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷及評估免疫功能提供理 論依據(jù)。前期研究表明,sMICA下調(diào)NK細(xì)胞的功能,而且隨著多數(shù)腫瘤病程的進(jìn) 展,sMICA在血清中的含量升高。Groh等發(fā)現(xiàn)sMICA能誘導(dǎo)T細(xì)胞表面NKG2的 內(nèi)吞和降解，并發(fā)現(xiàn)在胃腸惡性腫瘤患者的血清中含高水平的sMICA分子,且浸潤至腫瘤部位的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)和外周血T淋巴細(xì)胞表面NKG

12、2K體 的表達(dá)明顯低下,從而認(rèn)為是這些從腫瘤細(xì)胞表面釋放的 sMICA分子導(dǎo)致了 NKG2的下調(diào)，并進(jìn)一步嚴(yán)重影響了抗原特異性 T細(xì)胞的活性。Salih等11證實(shí) 白血病患者的瘤細(xì)胞亦表達(dá)NKG2阪體的配體MHC-I類分子鏈相關(guān)基因(MIC)和 UL 16結(jié)合蛋白(ULBP),且患者血清中亦含有高水平的 sMICA分子。Doubrovina 等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者血清中的高水平sMICA還可引起細(xì)胞毒性受體NKp44的表達(dá)下 調(diào),影響NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能。Jinushi等12發(fā)現(xiàn),晚期肝癌患者血清中sMICA 含量明顯高于早期患者。本研究結(jié)果顯示，食管癌患者與正常人相比，血清sMICA 含量明顯升高

13、，說明sMICA同樣與食管癌的進(jìn)程相關(guān)。但不同劑量放療后食管癌 患者血清sMICA的含量無明顯變化，提示放療雖然可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上調(diào)膜表面 MICA抗原表達(dá)，卻對MICA自腫瘤細(xì)胞表面脫落無重要影響。MICA與NKG2在抗腫瘤免疫中占有重要地位。NKG2在結(jié)腸癌患者的NK細(xì)胞/T細(xì)胞上的表達(dá)降低已得到證實(shí)13。本研究結(jié)果顯示,與正常人相比食 管癌患者外周血NK細(xì)胞NKG2表達(dá)降低,同時(shí)外周血NK細(xì)胞毒活性降低,提示食 管癌可通過下調(diào)NK細(xì)胞功能而逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。40-60 Gy的放療劑量時(shí)NK 細(xì)胞表面NKG2表達(dá)顯著上調(diào),NK細(xì)胞毒活性最強(qiáng),提示放療劑量不是越高越好, 過高的劑量不但損傷周圍正常的組織,而且損傷了患者的免疫功能，結(jié)果雖然提 高了腫瘤的局部控制率，反而降低了患者的遠(yuǎn)期生存率。另一方面,40-60 Gy的放療劑量引起NKG2陽性的NK細(xì)胞數(shù)增加及NK 細(xì)胞毒功能增強(qiáng)的原因并不清楚，可能與放療殺死腫瘤組織、降低腫瘤負(fù)荷有關(guān)。 而sMICA在