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1、超聲波輔助提取大豆異黃酮Mauricio a . Rostagno米格爾帕爾馬*,卡梅隆·g·巴羅佐2003年3月7日收到本論文, 2003年6月24日收到修訂版,發(fā)表于2003年7月2日摘要超聲波輔助提取與攪拌萃取在從冷凍、干燥的大豆中提取四個異黃酮衍生物（大豆苷、大豆異黃酮、染料木苷高效酰苷）相比，使用不同的溶劑、提取溫度。超聲波輔助法提高了大豆異黃酮的提取效率，但過于依賴于溶劑的使用。還進行了樣品的數(shù)量的比例的溶劑的體積和長度的提取時間的優(yōu)化。異黃酮可以定量從大豆中提取，最佳提取條件為50%乙醇為溶劑，提取溫度60，超聲時間20分鐘。2003 Elsevier B.V

2、.保留所有權(quán)利。關(guān)鍵詞:超聲波輔助提?。惶崛》绞?；大豆；異黃酮。1緒論異黃酮是在黃酮類化合物中發(fā)現(xiàn)的幾種植物衍生物。在大豆中它們以12個主要形式存在: 染料木苷、大豆異黃酮、大豆苷和各自的乙酰基，丙二酸和苷元形式1。令人感興趣的是，這些化合物由于其生物學(xué)效應(yīng)，包括雌激素和殺真菌毒性的活動。大豆異黃酮已證實可以降低患上乳腺癌，前列腺癌和結(jié)腸癌幾率，正在研究其防治更年期癥狀和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥（見參考文獻 2 的一個評論）。它們也可能是重要的抗氧化劑，因為他們有羥基基團在環(huán)羥基和/或B位置，因此能夠給自由基的氫。異黃酮的抗氧化活性可能是羥基的數(shù)目和位置有關(guān)3，4。通常,異黃酮提取使用含水甲醇（Me O

3、H)5,乙醇(Et OH)或乙腈(Me CN)7,8。墨菲9等，乙腈和丙酮(Ace)CN,與濃鹽酸,室溫下通過攪拌萃取2小時。格里菲斯和克里森10比較了80%Me OH和60%Me CN從大豆蛋白酸中提取異黃酮,大豆食品和營養(yǎng)補充劑。他們觀察到,相比80%Me OH ，60%Me CN為更高效的萃取溶劑80%Me OH。最近,墨菲等人。11評價Me CN,丙酮,Me OH,等,加入53%的水,都可以用來提取12個主要從大豆異黃酮提取物,使用攪拌萃取技術(shù)。根據(jù)這些作者,四種不同的溶劑在不同提取異黃酮形式呈現(xiàn)不同的功能。通過測試Me CN(47%),一般來說,是最好的萃取溶劑對大豆食品來說。大豆面

4、粉,Me OH(47%)比Me 取得了更高的苷元水平Me CN(47%),和Ace(47%),幾乎和Me OH一樣CN(47%),但略微降低了總異黃酮濃度。Me OH(47%),在大豆面粉,產(chǎn)生類似的結(jié)果對Me OH來說Me CN(47%)、Ace(47%)和Me OH在提取糖甙(47%),但較低的回收率得到丙二酸單酰苷。尋求更環(huán)保的方法和提高生產(chǎn)力,新提取技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來,包括超臨界流體萃取12、13和超聲波輔助提取(UAE)13、14。其中,超聲波輔助提取法是最便宜的技術(shù)和對儀器要求最低。超聲波作用下有機物的提取效率的提高是由于超聲波在溶劑中產(chǎn)生的空化現(xiàn)象。超聲波的應(yīng)用使空化泡的產(chǎn)生和壓

5、縮。壓縮引起的壓力和溫度的增加導(dǎo)致了氣泡的崩潰。隨著泡沫的破滅，導(dǎo)致“沖擊波”通過提高混合溶劑。超聲也產(chǎn)生機械作用,允許更多的溶劑滲透進入樣本的基質(zhì)中,增加固相和液相之間的接觸面積。再加上空化泡崩潰時產(chǎn)生的強化傳質(zhì)和重大能量破壞了細(xì)胞,增加了細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)品進入批量介質(zhì)。使用高溫在超聲波輔助提取法可以增加效率的提取過程由于空化氣泡形成的數(shù)量增加。盡管新技術(shù)已經(jīng)嘗試了提取異黃酮,但是這些研究是在非常有限的范圍和超聲波輔助提取法的完整評估仍然需要建立一個通用的協(xié)議。本實驗的目的是確定快速和可靠的超聲波輔助提取工藝最佳提取條件。2實驗部分21 實驗材料大豆經(jīng)咖啡研磨機粉碎、220烘干后冷藏待用。22 化

6、學(xué)藥品和溶劑The Me CN (Scharlau, Barcelona, Spain), Et OH (Panreac, Barcelona, Spain)和Me OH (Merck, Darmstadt, Germany)使用高效液相色譜法。水是由Milli-Q型凈水器系統(tǒng)從Milipore(Bedford, MA, USA)取得。異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和2,5-二羥基苯甲醛取自Sigma (圣路易斯,密蘇里州,美國)。23 提取大豆異黃酮進行高強度超聲波功率200 W和24 k赫茲(200s模型,Hielscher博士,德國)microtip配備2毫米探頭。其超聲振動振幅控制器將標(biāo)稱功率的100

7、%。超聲波浴360 W(J.P. Selecta,巴塞羅那,西班牙) 也被測試作為一種替代的超聲波探頭。拔掉進行恒定溫度的溫度控制器耦合超聲波浴。傳統(tǒng)提取方法攪拌萃取被用作參考與超聲波輔助提取法的方法。所有的實驗重復(fù)進行。三種不同的溶劑系統(tǒng),Me OHMe CN,與幾個水百分比(30 - 70%)和兩個溫度(10-60)對大豆異黃酮的提取進行了評估。最初使用提取方法0.5 g的冷凍干燥的大豆萃取溶劑25毫升提取10分鐘。這個方法進一步優(yōu)化了提取工藝。提取后,1毫升的2,5-攪拌萃取二羥基苯甲醛作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。然后將萃取液離心10 min，過濾，通過0.45毫米的尼龍注射器過濾器（微孔濾膜HN、愛

8、爾蘭）進行液相色譜分析。 24 高效液相色譜法(HPLC)高效液相色譜紫外分析的提取物在一個水系統(tǒng)由自動進樣器進行（717 +），泵控制器（600）、泵（616），和一個光電二極管陣列檢測器（996），使用一個RP-18柱（李chrospher 100、5毫米，默克）和梯度的酸化水（0.1%乙酸）（溶劑）和乙腈（0.1%乙酸）（溶劑B）在流速為0.3毫升/分鐘的梯度為0 min，10 min，15% B；30% B；20 min，25 min，30% B；100% B；35分鐘100%的紫外從200到400 nm吸光度監(jiān)測。紫外光譜記錄，并在254納米的異黃酮峰面積進行定量。進樣體積為10 m

9、L的校準(zhǔn)曲線（相關(guān)系數(shù)）對大豆黃酮、染料木苷、染料木素分別是y=44751x+8805 (r2=0.9980), y=77969x31141(r2=0.9967) 和 y=79785x55987 (r 2=0.9952)。檢出限(g/g) 染料木苷、染料木素和大豆苷元,分別為1.3、1.6和2.1。檢測極限計算使用該軟件18。每個異黃酮的定量是通過使用相應(yīng)的響應(yīng)因子b-glucoside集團和糾正的分子質(zhì)量的差異。據(jù)報道,這個方法檢測值最接近正確值。高效液相色譜質(zhì)譜(MS)的提取物的分析中進行Finnigan LCQ質(zhì)耦合系統(tǒng)的Finnigan墊(美國加利福尼亞州圣何塞熱電子,)。該設(shè)備配備一

10、個光譜系統(tǒng)2000模型梯度泵(美國熱分離產(chǎn)品,弗里蒙特,CA)和質(zhì)量檢測器(模型LCQ),由一個電噴射接口和一個離子阱質(zhì)量分析器。軟件的控制設(shè)備,數(shù)據(jù)的采集和處理是Xcalibur,1.2版。在LCUV應(yīng)用相同的梯度。進樣體積是100毫升。界面條件是:積極的電離模式中,毛細(xì)管溫度:220,噴涂電壓:4.6 k V,毛細(xì)管電壓:5 V,專注氣體流量:80(任意單元)和輔助氣體流量:10(任意單元)。ESI質(zhì)譜在200600 m/z范圍內(nèi)獲得。 分析了異黃酮糖甙黃豆苷,黃豆黃苷、精制和丙二酰萃取精制。每個異黃酮的識別是由比較保留時間與純粹的標(biāo)準(zhǔn),以及光電二極管陣列檢測和MS譜(圖1)。異

11、黃酮提取物的色譜分析HPLC-UV圖2所示。 3 結(jié)果與討論大豆樣本提取使用最初的協(xié)議(0.5 g,25毫升,10分鐘)和不同的溶劑系統(tǒng)在60(等哦,Me OHMe 和CN,30 - 70%)使用攪拌萃取和超聲波輔助提取法的方法。圖3顯示了個人的收益率(g / g)異黃酮和圖4總異黃酮的收益率(g / g)獲得了鉆井廢棄泥漿在不同的提取方法和提取溶劑在6010分鐘。圖1圖2大豆異黃酮的提取效率是提高了超聲波,但依賴于所使用的溶劑。幾乎所有的病例顯示,總用超聲波輔助提取法和個人異黃酮是(0 - 15%)高于同攪拌萃取。拔掉使用攪拌萃取超聲波輔助提取法也顯示類似的行為:當(dāng)使用純攪拌萃取效率低了,獲

12、得了用溶劑提取的最大40-60%的水。ET OH(50%),Me OH(50%)和Me CN(40%)產(chǎn)生的最高收益率的溶劑總異黃酮,他們之間只有微小的差異。黃豆苷的最佳提取溶劑為50%等哦,50%Me 與他們之間沒有區(qū)別。黃豆黃苷,最佳提取溶劑為50% ET OH。萃取精制,觀察50%等之間沒有區(qū)別哦,Me OH和40% CN 60%,丙二?；苌镙腿【频念愃平Y(jié)果。這些數(shù)據(jù)獲得的類似墨菲et al。11使用攪拌萃取技術(shù)2 h;他們國家,47%等哦是Me 效率47%和47%Me CN異黃酮糖甙的提取。顯然需要添加一定量的水(40-60%)萃取溶劑以提高大豆異黃酮的提取。這可能是由于這些化合

13、物的相對極性,并增加傳播的超聲波在水溶劑。提取效率的降低共有三個用大量的水溶劑(.60%),可以合理地依靠增加生產(chǎn)超聲波的激進分子離解的水。這些高能量的存在物種的氧化反應(yīng)可以同居萃取反應(yīng)時水是高于50%,目標(biāo)化合物的減少食物中可用矩陣提取,因此減少了提取效率。大豆還值得注意的是,在這個示例中,丙二酰基萃取精制和精制中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量要明顯高于其他異黃酮,黃豆黃苷是異黃酮葡萄糖苷最低的水平。因為沒有顯著差異觀察到50%等哦,Me OH和40% 50% CN在60,Me CN廢棄溶劑的選擇,因為它可能更對環(huán)境有害,而且更有毒和昂貴的比哦和Me OH。為了評估的影響溫度對異黃酮糖甙的提取效率,幾個拔牙進行

14、10使用超聲波輔助提取法和攪拌萃取方法。無花果。表3和表4顯示個人的收益率(g / g)和總異黃酮,泥漿在不同的提取方法和提取溶劑,在10,10分鐘。表1表2表3表4可以看出,溫度對異黃酮的提取有很大的影響。增加10到60的溫度顯著增加使用超聲波輔助提取法和攪拌萃取提取效率。拔牙在60提高萃取效率的異黃酮提取相比,在10。拔牙在60的更高的收益率可能部分歸因于空化氣泡形成的數(shù)量的增加和強化傳質(zhì)率。溫度似乎影響等噢和Me 一樣,因為類似行為的溶劑在觀察10到60。就是最好的復(fù)蘇得到使用相同的提取溶劑10和60。水的必要性(40 - 60%)萃取劑萃取時更明顯是在低溫下進行。非常低的復(fù)蘇的異黃酮測

15、試得到10使用純?nèi)軇?特別是在等哦。超聲波輔助提取法和攪拌萃取方法,在10到60,50%等哦似乎上提取溶劑提取總量和個人從地面冷凍干燥大豆異黃酮。雖然差異和個人總異黃酮的復(fù)蘇(黃豆黃苷除外)不重要,Et哦提供了幾個優(yōu)勢相比其他溶劑,低成本,較低的毒性和環(huán)境兼容性。在此基礎(chǔ)上,50%等哦,60選擇深造。因為超聲波輔助提取法經(jīng)濟復(fù)蘇產(chǎn)生高于攪拌萃取萃取的萃取條件,下面的優(yōu)化過程進行了超聲波輔助提取法。提取時間和樣本的數(shù)量必須進行調(diào)整,以獲得定量的復(fù)蘇。建立動力學(xué)的提取、使用的樣本數(shù)量是減少了從0.5到0.25,0.1和0.05 g(表1)和提取的時間延長到15,20到30分鐘(表2)。減少樣本量和

16、維護提取溶劑體積(25毫升)增加了樣本:溶劑比例有利于提取效率。這也會減少可用的異黃酮提取允許一個確定當(dāng)量化實現(xiàn)復(fù)蘇。減少樣本的數(shù)量和維護提取周期(10分鐘)不完善黃豆苷提取率,黃豆黃苷和丙二酰萃取精制(表1),只有萃取精制提取顯示一個小的數(shù)量增加(1.7 - -12.5%)與樣本容量的減少。所以,它可以得出的結(jié)論是,任何樣本質(zhì)量對提取溶劑體積比之間的0.5 g / 25毫升0.05 g / 25毫升可以使用,并會給類似的萃取效率。如上所述,僅觀察到萃取精制提取效率增加,表明仍有萃取精制樣品。因此提取時間延長。提取時間越長,異黃酮的提取效率越高,20分鐘(表2),20至30分鐘,測試所有異黃酮

17、的提取量略有下降?？赡苁茄趸赡馨l(fā)生20分鐘后提交聲波降解法。從這些數(shù)據(jù)Me 們可以推斷,通過抽取10分鐘,可以提取的一大部分大豆異黃酮(80 - 90%)存在于面粉樣品。如果客觀定量拔牙,拔牙的應(yīng)該使用20分鐘。為了驗證樣本中異黃酮的含量,并確保定量提取得到使用抽取20分鐘,拔牙(4325毫升)相同的樣品(0.5 g),使用50%等哦,6010分鐘,進行(表3)。異黃酮的總量中獲得的樣本的抽取,20分鐘(1353.47 g / g)相媲美,獲得抽取,使用50%等哦(1356.77 g / g)。因此,大豆的異黃酮含量(g / g)示例:黃豆苷:216.7767.67,黃豆黃苷:84.24&#

18、177;3.38,萃取精制:433.00±14.32,丙二酰基萃取精制:619.46±23。異黃酮苷元在大豆提取檢測極限以下。也是件有趣的事可以確定一個超聲波浴可以給探測角系統(tǒng)類似的萃取效率。為分析目的,這需要許多小體積樣品的處理,超聲波浴比的探測角可能更可取的提取。超聲波浴更廣泛使用,許多樣品可以同時處理,相比只有一次探測角。同時,聲波降解法與浴非侵入性的樣本,這將消除可能提取的污染和損失。個人的收益率(g/g)和總異黃酮獲得使用超聲波探頭和浴如表4所示。使用50%乙醇,60,提取效率基本沒有差異。使用50%,Me OH超聲波探頭和浴室之間的差異更明顯,尤其是對丙二酰萃取

19、精制。雖然有些差異觀察,但兩個系統(tǒng)可用于分析規(guī)模。評估提取過程的可重復(fù)性,一系列的五個樣品進行復(fù)制。獲得的結(jié)果(平均(g / g)±標(biāo)準(zhǔn)差)對黃豆苷(184.27±7.36),黃豆黃苷(66.89±3.14),精制(381.16±6.28)和丙二酰萃取精制(552.80±9.69)顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%。4 結(jié)論超聲波輔助提取是快速、可靠的提取方式，比攪拌萃取異黃酮的提取技術(shù)更好。乙醇(50%)是最好的提取溶劑，選擇從地面大豆中提取這些化合物,因其效率高、成本低、低毒性和環(huán)境兼容性。大量異黃酮提取在6010分鐘,20分鐘后提取率好。超聲波浴可以作

20、為替代探測角,因為兩種檢測探頭檢測值接近。參考文獻1 I .G. Grun, K. Adhikari, C. Li, Y. Li, B. Lin, J. Zhang, L.N. Fernando, J. Agric. Food Chem. 49 (2001) 2839.2 M.J. Messina, Am. J. Clin. Nutr. 70 (Suppl.) (1999) 439S.3 A. Arora, S. Valcic, S. Cornejo, M.G. Nair, P.N. Timmermann, Chem. Res. Toxicol. 7 (2000) 638.4 S. Toda,

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