一種Asia Ⅰ型口蹄疫重組表位蛋白的表達(dá)及免疫活性

1、一種Asia 型口蹄疫重組表位蛋白的表達(dá)及免疫活性    【摘要】  目的 構(gòu)建一種能預(yù)防Asia 型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重組蛋白疫苗，并對(duì)其免疫學(xué)活性進(jìn)行研究。方法 以Asia 型FMDV VP1上的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位氨基酸序列為抗原位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了包含上述位點(diǎn)的、具有最佳空間構(gòu)象的重組蛋白，命名為“CZ1”。通過(guò)PCR及基因克隆等方法構(gòu)建了其表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)鎳親和層析和G25凝膠過(guò)濾層析純化及復(fù)性，獲得具有免疫學(xué)活性的重組蛋白CZ1。免疫豚鼠獲得含針對(duì)Asia型FMDV中和抗體的血清，通過(guò)細(xì)

2、胞中和試驗(yàn)及乳鼠中和試驗(yàn)，檢測(cè)豚鼠血清中抗FMDV的保護(hù)性中和抗體滴度。結(jié)果 該基因工程重組蛋白能夠在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗Asia型FDMV具有保護(hù)性的中和性抗體。結(jié)論 該基因工程重組蛋白有望開(kāi)發(fā)成預(yù)防Asia型FDMV感染的新型疫苗。 【關(guān)鍵詞】  基因工程疫苗；FDMV；重組蛋白；活性檢測(cè)口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一種人和動(dòng)物共患的急性發(fā)熱性高度接觸性的傳染病1。傳統(tǒng)FMD疫苗為弱毒疫苗或滅活疫苗，雖具有良好的免疫原性，但由于存在著滅活不徹底以及防護(hù)不當(dāng)，而致病毒擴(kuò)散傳播的危險(xiǎn)，這些不安全因素促使人們尋求新型的疫苗。有研究證明，T和B細(xì)胞抗原原位串聯(lián)連接構(gòu)建而

3、成的基因工程疫苗能引起有效的機(jī)體免疫應(yīng)答，有利于具有保護(hù)性的中和抗體的產(chǎn)生2。本研究以Asia 型FMDV VP1上的B和T細(xì)胞表位氨基酸序列為抗原位點(diǎn)，采用計(jì)算機(jī)軟件篩選出最佳的表位組合形式，擬利用基因工程方法構(gòu)建、表達(dá)包含上述位點(diǎn)的氨基酸序列的重組蛋白，以探索一種新型的Asia型FMDV基因工程疫苗。1  材料與方法1.1  菌種、質(zhì)粒、引物、試劑、動(dòng)物及FMD滅活疫苗 JM109菌種、BL21(DE3)菌種、質(zhì)粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、dNTP、T4連接酶均購(gòu)

4、自TAKARA公司。IPTG購(gòu)自Promega。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或試劑純。層析介質(zhì)NiSepharose 4B、G25 Superdex 購(gòu)自Healthcare GE。牛AsiaFMD滅活疫苗購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古生物藥品廠。豚鼠購(gòu)自長(zhǎng)春高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。1.2  重組質(zhì)粒pET28aCZ1的構(gòu)建及鑒定 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選取Asia 型VP1上的B和T細(xì)胞表位的氨基酸序列，結(jié)合計(jì)算機(jī)空間構(gòu)象模擬篩選出多個(gè)T、B細(xì)胞表位串聯(lián)形式的重組蛋白。用PCR法構(gòu)建表位的基因序列，將其與pMD18T連接后，構(gòu)建串聯(lián)的重復(fù)序列；采用EcoR和Hind 雙酶切后，將基因片段亞克隆

5、至經(jīng)同樣雙酶切的pET28a（+）質(zhì)粒上，構(gòu)建成含目的基因片段的pET28aCZ1重組質(zhì)粒；送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。1.3  CZ1重組蛋白疫苗的表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28aCZ1轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌中，經(jīng)LB平板篩選后，挑取單克隆接種至LB培養(yǎng)液，于37、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液A600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37、220 r/min振蕩誘導(dǎo)、培養(yǎng)3 h，離心收集細(xì)菌。取誘導(dǎo)前后樣品進(jìn)行SDSPAGE鑒定。1.4  CZ1蛋白的純化 取10 g濕菌與裂菌液（含8 mol/

6、L尿素）按15(M/V)重懸后，4、攪拌4 h。10 000 r/min離心15 min，取上清加載至預(yù)先平衡的NiSepharose 4B層析柱中。用含4 mol/L尿素的洗滌液洗滌至A280到基線后，洗滌液中尿素濃度降至3 mol/L，洗滌1 h后，尿素濃度降至1 mol/L洗滌3 h后，洗脫CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加載到預(yù)先平衡的G25 Superdex層析柱中，收集CZ1蛋白。將每步驟留取的樣品進(jìn)行SDSPAGE鑒定。1.5  豚鼠免疫 取3只體重為300 g左右豚鼠，股內(nèi)側(cè)肌肉注射CZ1蛋白質(zhì)（200 g/只），同時(shí)設(shè)立PBS對(duì)照和Asia型FMDV滅活疫苗陽(yáng)

7、性對(duì)照。免疫后第21天采集血清。1.6  中和試驗(yàn) 96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中加50 l/孔的細(xì)胞維持液，再加入50 l/孔倍比稀釋的免疫后21 d的豚鼠血清，最后加入50 l/孔200 TCID50稀釋的病毒，CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加入BHK21細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，萘黑藍(lán)染色，Karber法計(jì)算血清中和抗體滴度。取滅活補(bǔ)體的免疫21 d后的豚鼠血清分別按132、164、1128、1256稀釋?zhuān)《居镁S持液稀釋至200 TCID50/100 l，將病毒稀釋液和各稀釋度的血清等量混合后，37 水浴1 h，乳鼠背部注射，100 l/只，每份血清的每個(gè)稀釋度注射4

8、只二日齡乳鼠，觀察并記錄注射后68 h每組乳鼠的存活情況，并以Karber法計(jì)算保護(hù)性中和抗體的滴度。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行兩組間方差檢驗(yàn)。2  結(jié)  果2.1  重組蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 通過(guò)DNA star軟件及Expasy網(wǎng)站，對(duì)表位的多種構(gòu)建方式進(jìn)行蛋白質(zhì)的二及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，篩選出一種能模擬天然構(gòu)象的表位組合形式，其空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，其RGD序列（如箭頭所示）充分暴露在細(xì)胞表面，可能有利于中和性抗體的產(chǎn)生。后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照這種表位組合形式構(gòu)建并表達(dá)目的蛋白，并命名為“CZ1”。2.2 

9、pET28aCZ1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)PCR法合成目的基因經(jīng)TA連接后，將其亞克隆至原核表達(dá)載pET28a，獲得重組質(zhì)粒pET28aCZ1。pET28aCZ1 經(jīng)EcoR I和Hind 雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預(yù)期相符（預(yù)期為945 bp），見(jiàn)圖2。DNA測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符。2.3  CZ1蛋白的表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pET28aCZ1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌后，接種至LB培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長(zhǎng)至A600=0.6時(shí)，加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。SDSPAGE分析顯示，目的蛋白質(zhì)分子量約為42 kD，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，表達(dá)產(chǎn)量約占菌體總蛋

10、白的50%左右。經(jīng)誘導(dǎo)后的菌體，以8 mol/L 尿素裂解包涵體，上清經(jīng)鎳親和層析和G25凝膠過(guò)濾層析純化，得到純度達(dá)到90% 的重組蛋白CZ1。見(jiàn)圖3。2.4  FMDV細(xì)胞中和試驗(yàn) 觀察在牛Asia 型FMDV活病毒的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和該病毒對(duì)BHK21細(xì)胞的感染。若該血清中含有針對(duì)牛Asia型FDMV的中和抗體，則可中和FMDV對(duì)BHK21細(xì)胞的感染而使其存活。結(jié)果顯示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗體滴度的幾何均數(shù)為286，滅活病毒組為320，與PBS組（3）比較差異顯著(P<0.01)。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了

11、針對(duì)Asia 型FMDV的中和抗體。2.5  中和試驗(yàn) 觀察在活的Asia 型FMDV的攻擊下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保護(hù)乳鼠抵抗該病毒的攻擊。將PBS組和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分別按132、164、1128、1256稀釋?zhuān)謩e與FMDV孵育1 h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清中含有針對(duì)Asia型FMDV的中和抗體，則乳鼠存活。結(jié)果顯示，CZ1重組蛋白免疫的3份豚鼠血清中，針對(duì)Asia I型FMDV的中和抗體滴度分別為190、1256和190，幾何均數(shù)為1127，與PBS組比較差異顯著(P<0.01)（表1）。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針

12、對(duì)Asia 型FMDV的中和抗體，能夠保護(hù)乳鼠抵抗同型活病毒攻擊。表1  CZ1蛋白免疫的豚鼠血清中抗FMDV中和抗體滴定水平(略)3  討 論    FMDV共有 A、O、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等7個(gè)血清型，血清型之間沒(méi)有交叉免疫3；在我國(guó)，F(xiàn)MD疫情主要以O(shè)型、A型、Asia三個(gè)血清型為主。2005 年初，我國(guó)江蘇、山東等省相繼暴發(fā)了Asia型FMD，感染動(dòng)物以牛為主，波及我國(guó)大多數(shù)省區(qū)4?；蚬こ桃呙缬捎诎踩行Аr(jià)廉、易于大規(guī)模生產(chǎn)等，成為新型疫苗研究的熱點(diǎn)。    在本研究中

13、，根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定三級(jí)結(jié)構(gòu)從而決定蛋白質(zhì)功能的原理，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬空間構(gòu)象的方法篩選最適的基因序列，這種方法大大節(jié)省了時(shí)間、節(jié)約了成本。在設(shè)計(jì)時(shí)，考慮我國(guó)及周邊國(guó)家Asia型 FMDV 流行株VP1 基因的抗原位點(diǎn)，以 FMDV VP1 的B和T細(xì)胞表位串聯(lián)的方式，成功地構(gòu)建了由6個(gè)表位組成的重組蛋白。選用大腸埃希氏菌作為表達(dá)系統(tǒng)，并考慮了大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，對(duì)部分基因序列進(jìn)行了同義突變，以便提高多表位基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率5，6，極大提高了重組蛋白CZ1的表達(dá)量，約占菌體總蛋白的50%。雖然pET表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物帶有6個(gè)His標(biāo)簽，易于純化，但大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)

14、的蛋白缺少諸如糖基化和磷酸化之類(lèi)的翻譯后修飾作用，常形成包涵體，不利于表達(dá)產(chǎn)物的純化回收，且對(duì)獲得有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物造成極大的困難。重組蛋白CZ1為包涵體表達(dá)，本室采用了在NiSepharose層析純化的同時(shí)，通過(guò)逐步降低洗滌緩沖液中的尿素濃度，使重組蛋白CZ1復(fù)性，實(shí)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)純化和復(fù)性同時(shí)進(jìn)行，極大簡(jiǎn)化了工藝。    本試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組蛋白疫苗能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生具有針對(duì)Asia 型FMDV的保護(hù)性中和抗體，可以中和該病毒對(duì)BHK21細(xì)胞的感染，且能夠保護(hù)乳鼠抵抗同型活病毒的攻擊，原因可能是由于重組蛋白CZ1能形成類(lèi)似于天然FMDV VP1蛋白的三維構(gòu)象。以上結(jié)果表明，該重組蛋白具有保護(hù)牛抵抗Asia 型 FMDV 的潛能，有可能