硫酸鎳致大鼠睪丸細胞線粒體及微粒體損傷

1、硫酸鎳致大鼠睪丸細胞線粒體及微粒體損傷                 【關(guān)鍵詞】 硫酸鎳；睪丸；線粒體；微粒體；氧化應激摘要： 目的 從氧化應激角度探討硫酸鎳(NiSO4)對大鼠睪丸細胞線粒體及微粒體的毒性作用。方法 健康性成熟Wistar雄性大鼠32只，隨機分為4組：生理鹽水(NS)組，硫酸鎳(NiSO4)125，250，500mg/kg組，等容積腹腔注射染毒，1次/d，連續(xù)30d。制備睪丸組織勻漿，離心提取線粒體和微粒體，采用分光

2、光度法檢測睪丸細胞線粒體及微粒體中脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)水平的變化。結(jié)果 染毒組與對照組比較，大鼠睪丸臟器系數(shù)無明顯變化(P005)。鎳可引起睪丸組織中LPO、ROS含量升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P005)；各染毒組TTOC均低于對照組(P<005)。結(jié)論 鎳對大鼠睪丸細胞的損傷可能與其所致的睪丸細胞線粒體及微粒體氧化應激效應增強有關(guān)。關(guān)鍵詞： 硫酸鎳；睪丸；線粒體；微粒體；氧化應激Oxidative damage of mitochondria and micriosome in testis cells induced by ni

3、ckel sulfate in rats Abstract： Objective To explore the mitochondria and microsome of testis cells caused by nickel sulfate in rate.Methods Thirtytwo male Wistar rats with sexual maturation were pided into four groups randomly,and three groups of rats were administrated intraperitoneally with nickel

4、 sulfate daily at doses 125,250，500 mg/kg respectively for 30 days,but the control group was administrated with saline in same volume according to the rats'weight.The mitochondria and microsome of testis cells were prepared by centrifugation technique to detect the levels of lipid peroxidation (

5、LPO),total antioxide capacity (T-AOC),reactive oxygen species (ROS) in spectrophotometry.Results The organ coefficient of testis exposed to NiSO4 had no change compared wth the control group(P005).The LPO and ROS contents in testis of exposure groups were higher than that of control group(P005),but

6、the T-AOC levels of the exposure groups were decreased compared with the control group(P001).Conclusion The rat's testis damage is related to the enhancement of oxidative stress of mitochondria and microsome caused by nickel sulfate.Key words： nickel sulfate;testis;mitochondria;microc 本文硫酸鎳致大鼠睪丸

7、細胞線粒體及微粒體損傷- ome;oxidative stress鎳是機體生命活動所必需的微量元素，其生物學作用極為廣泛，但其化合物又是當前主要的職業(yè)危害因素和環(huán)境污染物之一。過量鎳的攝入可造成機體多系統(tǒng)、多器官損傷，同時也是一種比較明確的致癌劑2，3。動物實驗發(fā)現(xiàn)，大劑量的鎳及其化合物對雄性實驗動物生殖功能具有毒性損害作用，鎳可透過血-睪屏障，蓄積在睪丸組織中4，引起睪丸生精代謝障礙，精子生成減少，形態(tài)發(fā)生改變，畸形率升高5，并可引起雄性大鼠性激素水平的改變6。研究發(fā)現(xiàn)，鎳可致大鼠血清、肌肉、肝臟和腎臟中脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量升高，并引起抗氧化酶活性的改變7，8。因此，本文從線粒體和微粒

8、體的氧化損傷角度探索鎳對睪丸生殖細胞損傷的機制，為鎳致雄性生殖毒性的防治提供理論依據(jù)。1 材料與方法11 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠，體重180220 g(蘭州大學實驗動物中心)。12 試劑和儀器 硫酸鎳(NiSO4)，分析純(西安化學試劑廠)。脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。Dptima XL100K型高速冷凍離心機(美國Meckman公司)。722型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。SHAB型水浴恒溫振蕩器(常州國華儀器廠)。13 方法131 劑量選擇與分組 健康Wistar雄性大鼠32只，隨機分為4組：

9、對照組(NS)，硫酸鎳125，250，50mg/kg組。連續(xù)腹腔注射染毒30d，1次/d，自由攝食飲水。132 樣品制備 (1)組織勻漿的制備：染毒結(jié)束次日，頸椎脫位法處死大鼠，迅速摘取雙側(cè)睪丸，稱重后取雙側(cè)睪丸，去包膜，放入表面皿中剪碎，加入勻漿介質(zhì)(001mol/L Tris-HCl緩沖液，pH74)，用玻璃勻漿器制成10%(w/v)的睪丸組織勻漿。(2)線粒體的制備：取10%的組織勻漿，用低溫冷凍離心機1 500r/min離心10min，棄沉淀，上清液再重復離心1次，棄沉淀，留取上清液用低溫高速冷凍離心機12000r/min離心15min，沉淀物即為線粒體。(3)微粒體的制備：取分離線粒

10、體后的上清液，用高速冷凍離心機40000r/min離心30min，沉淀物即為微粒體。將分離提取的線粒體和微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混懸液，超聲破膜后待用。133 指標檢測 每個樣品檢測2個平行樣，嚴格按照試劑盒說明書測定睪丸細胞線粒體和微粒體中LPO、TAOC、ROS的水平。14 統(tǒng)計分析 采用SPSS 100軟件進行單因素方差分析，并進行兩兩比較。2 結(jié)果21 染毒動物的一般狀況和睪丸臟器系數(shù)的變化(表1) 染毒早期動物出現(xiàn)輕微的興奮表現(xiàn)，染毒中期有精神萎靡，行動遲緩，毛發(fā)蓬松，拖尾等現(xiàn)象，染毒后期個別動物出現(xiàn)腹瀉癥狀，至染毒結(jié)束時未發(fā)現(xiàn)動物死亡情況。睪丸大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，硫酸鎳25

11、mg/kg組大鼠睪丸組織出現(xiàn)充血、水腫等現(xiàn)象，臟器系數(shù)略大于其他各組(P005)。50 mg/kg組睪丸臟器系數(shù)降低，與NS組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P005)。表1 NiSO4對大鼠睪丸細胞線粒體中LPO、TAOC、ROS的影響（略）注：與對照組比較，a P ) 005，b P001；n=8由表1可見，與對照組比較，染毒組大鼠睪丸細胞線粒體中T-AOC降低(P001)，LPO和ROS含量升高(P005)。22 NiSO4對大鼠睪丸細胞微粒體中LPO、T-AOC、ROS的影響(表2)表2 NiSO4對大鼠睪丸細胞微粒體中LPO、T-AOC、ROS的影響（略）注：與對照組比較,a P005，b

12、P001;n=8由表2可見，染毒組大鼠睪丸細胞微粒體中T-AOC降低(P<0.01)，LPO和ROS含量升高(P<0.05)。3 討論本實驗結(jié)果表明，硫酸鎳腹腔注射染毒后，大鼠睪丸細胞線粒體的氧化應激效應增強，提示此時線粒體產(chǎn)生過量ROS，引發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化生成大量的LPO，同時抑制T-AOC活性，引起線粒體內(nèi)膜跨膜電位的下降，導致線粒體膜通透性發(fā)生變化，甚至出現(xiàn)線粒體DNA的廣泛損傷9，進一步引起睪丸生殖細胞的損傷。本文結(jié)果顯示，鎳可導致微粒體氧化應激效應增強，引起微粒體膜的損傷及其氧化酶類活性的變化，造成睪丸細胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，鎳可導致大鼠睪丸組織勻漿中ROS、LPO和T-A

13、OC水平的改變。Kodipura等報道，鎳可導致小鼠睪丸組織細胞勻漿、線粒體和微粒體中LPO含量升高，抑制谷胱苷肽過氧化物酶和S-轉(zhuǎn)移酶活性，使乳酸脫氫酶活性升高，與本次實驗結(jié)果一致。因此，本實驗結(jié)果提示，線粒體和微粒體氧化應激水平的增強可能是鎳致睪丸細胞損傷的機制之一。參考文獻1 剛葆琪，莊志雄.我國鎳毒理學研究進展J.衛(wèi)生毒理雜志，2000,14(3):129-135.2 Denkhaus E,Salinikow K.Nickel essentiality,toxicity,and carcinogenicityJ.Critical Reviews in Oncology Hematolo

14、gy,2002,42:35-36.3 Sunderman FW Jr.Mechanisms of nickel carcinogenesisJ.Scand J Work Environ Health,1989,15:2-32.4 Obone E,Chakrabarti SK C,et al.Toxicity and bioaccumulation of nickel sulfate in SpragueDawley rats following 13 weeks of subchronic exposureJ.J Toxicol Environ Health A,1999,57:379-401

15、.5 Pandey R,Kumar R,Singh SP,et al.Male reproductive effect of nickel sulphate in miceJ.Biometals,1999,12:339-346.6 孫應彪，朱玉真，王學習.硫酸鎳對雄性大鼠生殖損傷的研究J.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2003，4(21)：257-259.7 Stinson TJ,Jaw S,Jeffery EH.The relationship between nickel chlorideinduced peroxidation and DNA strand breakage in rat li

16、verJ.Toxicol Appl Pharmaco,1992,117:98-193.8 Chen CY,Huang YL,Lin TH.Association between oxidative stress and cytokine prodution in nickeltreated ratsJ.Arch Biochem Biophys,1998,356:127-132.9 Vaca CE,Wilhelm J,Ringdahl MH.Interaction of lipid peroxidation products with DNA:a reviewJ.Mutat Res,1988,195:137-149.10 王麗娟，孫應彪.硫酸鎳對大鼠睪丸細胞氧化應激效應的影響J.中國公共衛(wèi)生，2006，6(22)：713-714.11 Kodipura Doreswamy,Balakishna Shrilatha,Thimappa Rajeshkumar,et al.Nickelinduced oxidati