HPLC測定有關(guān)物質(zhì)和含量方法驗證小結(jié)

1、本貼的目的：討論目前審評尺度下，藥品研發(fā)過程中，分析方法的驗證項目及目的，試驗方法，試驗要求 本帖僅僅針對于HPLC方法進行討論方法開發(fā)的內(nèi)容不在本帖討論范圍內(nèi)1有關(guān)物質(zhì)（適用于API，制劑，也適用于起始物料，中間體）有關(guān)物質(zhì)方法驗證的前提條件：1.各雜質(zhì)與主峰的混合溶液能用擬定的分析方法有效分離2.根據(jù)混合溶液中各峰的紫外吸收波長（或單獨測定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測波長。多波長檢測（如有）則分別考察。3.在檢測波長下，選擇峰高最小的，計算S/N，預(yù)估主成分濃度4.各雜質(zhì)純度已知5.根據(jù)合成跟蹤檢測，合理制定各雜質(zhì)的限度6.供試品溶解方法和提取方法得到合理證明1.1專屬性：1.1.1概

2、念在其他成分（如其他雜質(zhì)，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測定被檢測物的能力。1.1.2試驗方法1.1.2.1定位試驗：A.目的對各已知雜質(zhì)和主峰進行定位B.試驗方法：a配制一定濃度（能夠顯示出峰純度，一般為0.1mg/ml）的各已知雜質(zhì)溶液、擬檢測濃度的主成分作為定位溶液b配制限度濃度各已知雜質(zhì)與檢測濃度的主成分的混合溶液作為分離度試驗溶液c使用擬定分析方法分別進行定位。C.試驗要求：a空白應(yīng)不干擾各雜質(zhì)的測定：如雜質(zhì)附近有空白峰，二者分離度應(yīng)大于1.5；雜質(zhì)峰保留時間處不得為梯度峰拐點b定位溶液中，已知雜質(zhì)與主峰的峰純度應(yīng)符合規(guī)定c分離度試驗溶液中，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度

3、應(yīng)大于2.0（至少1.5）；各已知雜質(zhì)之間的分離度應(yīng)大于1.5（至少1.2）；1.1.2.2強制降解試驗A.目的一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn)定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途徑與降解產(chǎn)物。其二，這些試驗也能在一定程度上對有關(guān)物質(zhì)分析方法用于檢查降解產(chǎn)物的專屬性進行驗證。B.試驗方法對于高溫、光照、強酸、強堿及強氧化劑的濃度及時間、取樣方式等沒有明確的規(guī)定。具體品種具體模索，初步試驗了解樣品對影響的因素（高溫、光照、酸、堿、氧化）等條件基本穩(wěn)定情況后，進一步調(diào)整破壞試驗條件，只要使主藥有一定量的降解，并對可能的降解途徑和降解機制進行分析，保證實驗的意義即可。試驗一般的范圍為：強酸

4、：0.15.0mol/L HCl溶液或視情況調(diào)節(jié)時間，溫度，體積強堿：0.15.0mol/L NaOH溶液或視情況調(diào)節(jié)時間，溫度，體積強氧化劑：30%的H2O2或視情況配制不同濃度的溶液或視情況調(diào)節(jié)時間，溫度高溫：固體狀態(tài)下穩(wěn)定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態(tài)進行試驗光照：固體狀態(tài)下穩(wěn)定的主藥，可以考慮溶解后以液體狀態(tài)進行試驗C.試驗要求a.一般樣品含量控制在85%90%范圍（歸一化法），不一定要求每個條件都能降解出來。b.在進行酸、堿、強氧化破壞試驗時，每個試驗最好都要做相應(yīng)的空白（溶劑，空白輔料，復(fù)方制劑還包括除去某一主藥的其他組分）破壞試驗作為輔助。c.主峰純度符合規(guī)定，與相鄰雜質(zhì)分離度

5、大于2.0（至少1.5），已知雜質(zhì)與相鄰雜質(zhì)分離度大于1.2d.物料守恒，即未破壞主藥的C/A與破壞后的C/A值相比，結(jié)果在0.91.1之間e.關(guān)于破壞試驗，更多內(nèi)容請參閱lyslinjiu版主在帖子【討論】2013-專屬性實驗（強制降解試驗）2013-專屬性實驗（強制降解試驗） - 丁香園論壇f.在此處做梯度時間（如有）延長驗證試驗。即將分析方法的梯度中，有機相比例最大的時長延長（建議延長時間為主峰保留時間或1020min），考察是否降解出難以洗脫的物質(zhì)在擬定方法的梯度周期內(nèi)能有效檢出。進一步考察分析方法的合理性1.2定量限1.2.1概念樣品中能被定量測定的最低量，有定量意義。1.2.2驗證

6、方法A.目的考察雜質(zhì)的能被定量的最低量，同時評判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗方法配制限度濃度的各已知雜質(zhì)與主成分的混合溶液作為貯備液，進樣，逐步稀釋至S/N約為10時，得定量限。C.試驗要求定量限濃度不得高（修正，原為低）于限度濃度的1/51.3檢測限1.3.1概念樣品中能被檢測出的最低量，僅作為限度試驗指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。1.3.2驗證方法A.目的考察雜質(zhì)的最低檢出量，同時評判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗方法配制限度濃度的各已知雜質(zhì)與主成分的混合溶液作為貯備液，進樣，逐步稀釋至S/N約為3時，得檢測限。C.試驗要求檢測限濃度不得高（修正，原為低）于限度濃度的1/101

7、.4溶液穩(wěn)定性1.4.1目的考察被測各溶液在特定時間周期內(nèi)的穩(wěn)定性1.4.2試驗方法a.配制系統(tǒng)適應(yīng)性溶液、供試品溶液、對照品溶液，在室溫條件下，分別在各時間點進樣b.如不穩(wěn)定，需考察在低溫條件下的溶液穩(wěn)定性c.時間范圍根據(jù)試驗需要來確定。比如做回收率中需要至少連續(xù)測定9份供試品，是所有單個驗證項目中最長的，選擇這個時間點是可以的。也有考慮到以后需要測定更多的樣品，選擇更長的時間范圍。1.4.3試驗要求a.系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，各峰之間分離度應(yīng)符合要求。b.對照品溶液峰面積RSD應(yīng)小于2.0%c.供試品溶液，雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)量應(yīng)一致，峰面積RSD應(yīng)小于5.0%；不得檢出新增雜質(zhì)d.如不穩(wěn)定，需臨用現(xiàn)配

8、或低溫保存1.5儀器精密度1.5.1概念同一溶液，連續(xù)進樣6次，其tR和峰面積的精密度，考察儀器的進樣精密度1.5.2試驗方法配制限度濃度的各雜質(zhì)和主成分的混合溶液，連續(xù)進樣6次1.5.3試驗要求a.tR的RSD小于2.0%b.各峰面積RSD小于2.0%1.6線性與校正因子1.6.1概念在設(shè)計的范圍內(nèi)，被測物濃度與峰面積的線性關(guān)系1.6.2試驗方法配制各雜質(zhì)和主成分的混合溶液，逐步稀釋，濃度范圍從定量限至限度濃度的120%以上，至少配制5份以上溶液。由2人分別進行。1.6.3試驗要求a. 線性關(guān)系系數(shù)r大于0.990b.Y軸截距應(yīng)在100響應(yīng)值的25以內(nèi)c. 響應(yīng)因子的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%

9、d.2人測得斜率之比在0.981.02之間e.計算出來的校正因子應(yīng)進行修約，在0.91.1范圍內(nèi)的，修約為1.0進行計算；0.25.0范圍內(nèi)的，按校正因子計算；0.25.0范圍外的，按外標(biāo)法計算。1.7精密度1.7.1概念同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定結(jié)果之間的接近程度。1.7.2重復(fù)性1.7.2.1試驗方法由同一試驗人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測定雜質(zhì)百分含量。1.7.2.2試驗要求a.檢出雜質(zhì)個數(shù)，雜質(zhì)相對保留時間，各雜質(zhì)百分含量均應(yīng)一致b.單個雜質(zhì)的百分含量的極差應(yīng)在其含量±10%以內(nèi)c.雜質(zhì)總量的RSD應(yīng)小于5.0%1.7.3中間精密度1.7.3.1試驗

10、方法同一實驗室，由不同試驗人員在不同時間使用不同設(shè)備，平行配制6份供試品溶液，測定雜質(zhì)百分含量。1.7.3.2試驗要求a.同1.7.2.2-a和bb.單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量的RSD應(yīng)小于10.0%1.8回收率1.8.1概念用擬定分析方法所測得結(jié)果與真實值接近的程度。1.8.2試驗方法a.配制各雜質(zhì)的混合貯備液b.稱取供試品適量，精密加入混合雜質(zhì)貯備液適量，配制成溶液，使供試品濃度為測定濃度，雜質(zhì)濃度分別為限度濃度的50%，100%，150%。各濃度均平行配制3份c.配制混合雜質(zhì)對照品溶液和自身對照溶液1.8.3試驗要求a.各濃度下的回收率應(yīng)在90%110%之間b.回收率（N=9）的RSD應(yīng)小于10

11、.0%c.用加校正因子的自身對照法計算結(jié)果應(yīng)與雜質(zhì)外標(biāo)法計算結(jié)果一致1.9耐用性1.9.1概念在擬定的分析方法有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的分析方法用于常規(guī)檢測提供依據(jù)1.9.2試驗方法a.分析方法中可變動的因素有：流動相組成比例，水相pH，柱溫，色譜柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色譜柱），流速，檢測波長b.配制系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，供試品溶液，對照品溶液進行測定1.9.3試驗要求a.系統(tǒng)適應(yīng)性溶液應(yīng)符合規(guī)定；如不符合規(guī)定，則需更嚴(yán)格控制所變化的因素，直至找到一個合適的范圍；如指定色譜柱，嚴(yán)格控制pH等等b.檢測雜質(zhì)個數(shù)，雜質(zhì)的相對保留時間應(yīng)與精密度結(jié)果一致c.測得雜質(zhì)量

12、應(yīng)與精密度結(jié)果一致2含量測定（適用于API，制劑，也適用于單個雜質(zhì)控制）含量測定方法驗證的前提條件：1.空白（溶劑和輔料）和各雜質(zhì)不干擾主峰的測定2.根據(jù)主成分的紫外吸收波長（復(fù)方需分別單獨測定各組分紫外吸收），選擇合適的檢測波長。多波長檢測（如有）則分別考察。3.在檢測波長下，計算S/N，預(yù)估主成分濃度4.供試品溶解方法和提取方法得到合理證明2.1專屬性：2.1.1概念在其他成分（如其他雜質(zhì)，輔料，溶劑）可能存在的情況下，擬定的分析方法能正確測定主成分的能力。2.1.2試驗方法2.1.2.1定位試驗：A. 目的同1.1.2.1-AB.試驗方法同1.1.2.1-BC.試驗要求：a空白應(yīng)和各雜質(zhì)

13、不得干擾主成分的測定，主峰保留時間處不得為梯度峰拐點（如有）b定位溶液中，主峰的峰純度應(yīng)符合規(guī)定c分離度試驗溶液中，主峰與相鄰雜質(zhì)的分離度應(yīng)大于2.02.1.2.2強制降解試驗A.目的一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn)定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途徑與降解產(chǎn)物。其二，這些試驗也能在一定程度上對含量測定分析方法用于檢查主成分的專屬性進行驗證。B.試驗方法同1.1.2.2-BC.試驗要求a.主峰純度符合規(guī)定，與相鄰雜質(zhì)分離度大于2.0其他同1.1.2.2-C2.2定量限2.2.1概念樣品中能被定量測定的最低量，有定量意義。2.3.2驗證方法A.目的考察主成分的能被定量的最低量，同時評

14、判供試品濃度的選擇是否合理B.試驗方法配制檢測濃度的主成分溶液，進樣，逐步稀釋至S/N約為10時，得定量限。C.試驗要求定量限濃度不得高（修正，原為低）于檢測濃度的1/102.3溶液穩(wěn)定性試驗要求為主成分峰面積RSD小于2.0%如溶出檢測方法同含量，建議考察一個溶出曲線周期內(nèi)的溶液穩(wěn)定性其他同1.4項下2.4儀器精密度試驗要求為主成分峰面積RSD小于2.0%其他同1.5項下2.5線性與校正因子2.5.1概念在設(shè)計的范圍內(nèi)，被測物濃度與峰面積的線性關(guān)系2.5.2試驗方法配制主成分貯備液，逐步稀釋，濃度范圍從檢測濃度80%至120%，至少配制5份以上溶液。由2人分別進行。2.5.3試驗要求同1.6

15、.32.6精密度2.6.1概念同一個均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定結(jié)果之間的接近程度。2.6.2重復(fù)性2.6.2.1試驗方法由同一試驗人員，取同一均勻供試品，平行配制6份供試品溶液，測定主成分百分含量。2.6.2.2試驗要求6份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%2.6.3中間精密度2.6.3.1試驗方法同一實驗室，由不同試驗人員在不同時間使用不同設(shè)備，平行配制6份供試品溶液，測定主成分百分含量。2.6.3.2試驗要求a.6份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%b.12份供試品含量結(jié)果RSD應(yīng)小于2.0%2.7回收率2.7.1概念用擬定分析方法所測得結(jié)果與真實值接近的程度。2.7.2試驗方法a.API在精密度，線