新城疫病毒抑制肝星狀細(xì)胞活化的初步研究

1、新城疫病毒抑制肝星狀細(xì)胞活化的初步研究李亞琳渭南肺范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陜西渭南714099摘要：目的探討新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)在活化肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellatecell,HSC)中的復(fù)制對(duì)HSC的活化增殖和細(xì)胞生物學(xué)功能的阻礙。方式用不同滴度的NDV溶瘤株Italien(NDV-Italien)感染經(jīng)transforminggrowthfactor-P1(TGF-B1)刺激活化的人肝星狀細(xì)胞系LX-2,MTT法檢測(cè)NDV對(duì)細(xì)胞增殖率的阻礙。免疫熒光顯微鏡技術(shù)檢測(cè)活化標(biāo)志物a-SMA的表達(dá)轉(zhuǎn)變。結(jié)果NDV的感染抑制了LX-2細(xì)胞的增殖，

2、細(xì)胞增殖率和病毒滴度呈負(fù)相關(guān)。與未刺激組相較，NDV在TGF-P1刺激的LX-2細(xì)胞中的增殖抑制率提高，LX-2細(xì)胞的活化標(biāo)志物Q-SMA的表達(dá)顯著性下調(diào)。結(jié)論NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制具有抑制細(xì)胞增殖和HSC活化的作用。關(guān)鍵詞：新城疫病毒；肝星狀細(xì)胞；TGF-P1ApreliminarystudyofNewcastlediseasevirusrepressingtheavtivationofhepaticstellatecellYaiinLiCollegeofChemistryandLifeScience,WeinanTeacherUniversily,Weinan.Shaanxi.C

3、hina.714099Abstract:AlmToexploretheinfluenceofNDVreplicationonLX-2cellsonthecellviabilityandbehaviorofcellularbiology.MethodsTransforminggrowthfactor-01(TGF-pi)-stimulatedLX-2cellswereinfectedbydifferenttitresofoncolyticNDV-Italien,theproliferationrateofLX-2cellswasdetectedbyMTTassay.Immunofluoresce

4、nttechniquewasusedtodetecttheexpressionofactivationmarkersa-SMAinLX-2cells.ResultsNDVinfectioninLX-2cellsrepressedthecellproliferationinadose-dependentmanner.Comparedwithcontrol,thegrowthinhibitionrateofactivatedLX-2cellswasincreased,theexpressionofactivationmarkersa-SMAofLX-2cellsweredown-regulated

5、.ConclusionThereplicationofNDVinactivatedLX-2cellsrepressesthecellproliferationandattenuatedtheactivationofLX-2cells.Keywords:Newcastlediseasevirus;hepaticstellatecell;TGF-01基金項(xiàng)目：陜西省教育廳資助項(xiàng)目（新城疫病而抑制肝星狀細(xì)胞活化的體內(nèi)外研究），（項(xiàng)目編號(hào)：009JK,127）：渭南師范學(xué)院基金資助項(xiàng)目（新城疫病毒抑制小鼠肝纖維化的機(jī)制研究），（項(xiàng)目編號(hào)：10YKZ054）作者單位：714000陜西省渭南市，渭南師范學(xué)

6、院作者簡(jiǎn)介：李亞琳，女，博士，副教授，要緊從事腫瘤生物醫(yī)治研究Email：通信地址：陜西省渭南市朝陽路西段渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，聯(lián)系：2133096,電話：肝星狀細(xì)胞（HSC）活化是肝纖維化發(fā)生的要緊緣故，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理時(shí)期。免疫組化研究顯示，肝癌歸并肝硬化中活化的HSC數(shù)量顯著增高，而肝癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也具有增進(jìn)HSC活化并增殖的作用；活化HSC和癌變細(xì)胞的彼此作用會(huì)進(jìn)一步加重肝癌歸并肝硬化程度。因此著眼于活化HSC的靶向醫(yī)治是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬

7、副粘病毒科。由于多數(shù)RNA病毒具有天然地在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)，最近幾年來用這種病毒作為新型運(yùn)載工具在腫瘤基因醫(yī)治方面引發(fā)了人們的關(guān)注刃。而咱們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了NDV也能夠在活化的HSC中復(fù)制?；谀莻€(gè)研究基礎(chǔ)，本研究通過測(cè)定細(xì)胞增殖和a-SMA的表達(dá)，證明了NDV在活化的HSC中的復(fù)制對(duì)HSC的增殖和活化標(biāo)志蛋白a-SMA的表達(dá)的抑制作用，從而為以肝星狀細(xì)胞為靶點(diǎn)的肝癌歸并肝纖維化醫(yī)治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料11細(xì)胞與病毒人肝星狀細(xì)胞系LX-2,美國(guó)MountSinai醫(yī)學(xué)院ScottL.Friedman教授饋贈(zèng);溶瘤株NDV-Italien由德國(guó)癌癥研究中心VolkerSchirrma

8、cher教授饋贈(zèng)。1.2要緊試劑DMEM培育基購(gòu)于美國(guó)Hycolon；新生牛血清購(gòu)于中國(guó)杭州四季青公司；重組人TGF-pl購(gòu)于以色列PeproTechAsia；鼠抗人a-SMA一抗購(gòu)于英國(guó)Abeam；羊抗鼠偶聯(lián)AlexaFluor594IgG二抗購(gòu)于美國(guó)Invitrogeno2方式2.1MTT檢測(cè)NDV感染對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的阻礙LX-2細(xì)胞以5xl（）3cells/孔接種在96孔板中培育24h,然后換以小牛血清的DMEM饑餓24ho然后用2ng/ml的TGF-pl（W/V,用含2%NBCS的DMEM配制）刺激LX-2細(xì)胞24h,以不同滴度的NDV感染細(xì)胞，細(xì)胞培育24h后，MTT法檢測(cè)NDV

9、對(duì)細(xì)胞增殖的阻礙。2. 2免疫熒光檢測(cè)NDV感染后a-SMA在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)LX-2細(xì)胞以lxlO%ells/孔接種在6孔板中（預(yù)鋪蓋玻片）。培育24h后,用NDV-Italien（1:400稀釋）感染細(xì)胞。繼續(xù)培育24h后，掏出蓋玻片，進(jìn)行a-SMA的免疫熒光檢測(cè),步驟如下：PBS洗3次,4%多聚甲醛固定10min：%的TritonX-100（用PBS配）滲透5min；PBST（含Tween-20的PBS）洗2次后，用5%的羊血清室溫封鎖20min：直接加入鼠抗人a-SMA一抗（1:50稀釋），37孵育1h；PBST洗3次后，加入偶聯(lián)AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗（1:8

10、00稀釋），37避光孵育30min：PBST洗2次后，用DAPI（1:5,000稀釋）染核2min；PBS洗3次，熒光顯微鏡觀看a-SMA在細(xì)胞中的表達(dá)。2.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)用三個(gè)獨(dú)立樣本的均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差來表示（x土s）,用獨(dú)立t查驗(yàn)（independentStudentst-test）來分析不同組之間的不同顯著性，顯著性界限定為PV（雙尾）。所有結(jié)果通過SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來完成。3結(jié)果3. 1NDV抑制LX2細(xì)胞的增殖LX-2細(xì)胞會(huì)隨著傳代培育而自發(fā)活化。為了考查NDV對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖阻礙，實(shí)驗(yàn)用不同稀釋濃度的NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細(xì)胞和用2ng/mlTGF-pl刺

11、激活化的LX-2細(xì)胞，并用MTT方式檢測(cè)NDV對(duì)兩組細(xì)胞增殖阻礙。如圖1所示，LX-2細(xì)胞不管是在未刺激狀態(tài)仍是刺激后的活化狀態(tài)，NDV均能夠抑制細(xì)胞的增殖（A）,且具有劑量依托性?？墒荖DV對(duì)2ng/mlTGF-pl刺激活化細(xì)胞的增殖抑制率更高（B）,與未刺激組相較具有顯著性不同（PV）。2 ng/mITGF-plNDVZ-U0 汽ThedilutionofNDV2 ng/ml TGF-P1 NDV86420864201111130U。三(=一三1/16001/32001/64001/12800ThedilutionofNDV圖1NDV對(duì)LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。LX-2細(xì)胞經(jīng)2ng/ml

12、TGF-pl預(yù)刺激后，再用NDV-Italien感染24h。MTT檢測(cè)細(xì)胞在490nm時(shí)的吸光度值(A),并計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(B)o數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立檢測(cè)的平均值(xs).Figure1TheproliferationofLX-2CellswasinhibitedbyNDV.LX-2cellswerepretreatedwith2ng/mlTGF-01,theninfectedwithNDV-Italienfor24h.CellproliferationwasdetectedusingMTTassayatwavelengthof490nm(A)andcellgrowthinhibitionra

13、tewascalculated(B).Datarepresentthemeansoftriplicate.3. 2NDV抑制LX-2細(xì)胞的aSMA表達(dá)實(shí)驗(yàn)用NDV-Italien感染傳代到第5代的LX-2細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中a-SMA的表達(dá)。結(jié)果顯示，在NDV感染前，LX-2細(xì)胞中有較強(qiáng)的a-SMA表達(dá)(圖2A)；而NDV感染后，細(xì)胞中a-SMA的表達(dá)明顯消失(圖2B)。圖2LX-2細(xì)胞中a-SMA的表達(dá)。LX-2細(xì)胞接種在6孔板中培育24h,用NDV-Italien感染細(xì)胞。24h后，細(xì)胞被固定、滲透，羊血清封鎖后加入鼠抗人a-SMA一抗，37，C孵育11】。加入偶聯(lián)AlexaFluo

14、r594的羊抗鼠IgG二抗，379孵育30min0用DAPI染核后，熒光顯微鏡觀看aSMA的表達(dá)。NDV感染前(A)；NDV感染后(B),(放大倍數(shù)400x)Figure2Theexpressionofa-SMAinLX-2cells.LX-2cellswereinoculatedin96-wellplatesandculturedfor24hfollowedbyinfectionwithNDV-Italien.After24h,thecellswerefixed,permeabilized,blockedbygoatserumandincubatedwithmouseanti-humana-

15、SMAantibodyat37for1h.ThensectionswereincubatedwithAlexaFlour594goatanti-inouseIgGsecondaryantibodyfor30minat37.AfterstainedthenucleuswithDAPI,a-SMAexpressionwerevisualizedunderafluorescencemicroscope.BeforeNDVinfection(A);AfterNDVinfection(B).(Magnification400x)4討論活化HSC高表達(dá)a-SMA,因此a-SMA已經(jīng)被用作判定HSC活化和纖

16、維化進(jìn)展的標(biāo)志。而在HSC活化和肝纖維化進(jìn)程中，TGF-pl無疑是一個(gè)重要的調(diào)劑因子，是HSC活化的一個(gè)關(guān)鍵因素。TGF-pl能夠增進(jìn)HSC由星狀的靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)型為成肌纖維細(xì)胞樣的活化狀態(tài)，誘導(dǎo)HSC活化并產(chǎn)生過量的ECM進(jìn)而形成肝纖維化億叫HSC活化和肝纖維化的發(fā)生與肝癌發(fā)生也有緊密的關(guān)系。國(guó)內(nèi)幾個(gè)報(bào)導(dǎo)均用免疫組化證明了肝癌組織中活化的HSC明顯高于正常組織陽叫體外實(shí)驗(yàn)證明HSC在肝癌的血管生成中起要緊作用口】。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)大鼠的肝癌細(xì)胞能增進(jìn)HSC的召募和活化；而肝臟損傷后病變的肝細(xì)胞也能誘導(dǎo)HSC的活化1口。因此，肝癌發(fā)生進(jìn)展進(jìn)程中，活化的肝星狀細(xì)胞和病變的肝細(xì)胞彼此作用，一起增進(jìn)腫瘤發(fā)生進(jìn)

17、程，而靶向HSC的抗纖維化醫(yī)治也成為阻止肝癌發(fā)生的有效途徑之一也。咱們以前的實(shí)驗(yàn)也證明了TGF-pl具有增進(jìn)HSC活化作用，而且用不同方式證明了NDV能夠在活化LX-2細(xì)胞中高效復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)一步的研究工作探討NDV在活化LX-2細(xì)胞中的復(fù)制對(duì)細(xì)胞的增殖和活化功能的阻礙，證明了NDV在活化HSC中的復(fù)制能夠抑制該細(xì)胞的增殖及活化，并降低細(xì)胞內(nèi)一些活化相關(guān)基因的表達(dá)。MTT方式證明，LX-2細(xì)胞不管是不是被TGF-pl預(yù)刺激，NDV均劑量依托性地抑制細(xì)胞的增殖。TGF-pl刺激后，細(xì)胞在490nm的吸光度值和計(jì)算所得的生長(zhǎng)抑制率整體高于未刺激組，說明TGF-P1的刺激誘導(dǎo)了LX-2細(xì)胞的增殖

18、，增進(jìn)細(xì)胞的活化。而當(dāng)NDV感染后，其在TGF-pl刺激活化的LX-2細(xì)胞的復(fù)制率更高，從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也比為刺激組高。那個(gè)結(jié)果說明NDV更易在刺激活化的細(xì)胞中復(fù)制而引發(fā)更高的細(xì)胞死亡率，即NDV的復(fù)制效率越高，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也越高，對(duì)細(xì)胞活化的抑制也加倍有效。為了證明NDV的復(fù)制能夠抑制HSC的活化，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NDV感染對(duì)LX-2細(xì)胞中的a-SMA表達(dá)的阻礙。同預(yù)期結(jié)果一樣，NDV感染后a-SMA表達(dá)明顯消失。說明NDV的復(fù)制確實(shí)專門大程度地降低了LX-2的活化程度。NDV能在活化HSC中相對(duì)高效地復(fù)制，進(jìn)而抑制細(xì)胞的活化功能。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)聽說明：NDV在活化HSC中的復(fù)制，能夠抑制

19、HSC的增殖和活化相關(guān)蛋白的表達(dá)，很大程度地抑制了HSC的活化功能。該結(jié)果為將NDV進(jìn)一步用于抑制肝纖維化和肝癌醫(yī)治提供必然的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1 Myofibroblastsandhepatocellularcarcinoma:aninvivoandinvitrostudyJ|.JHepatol.1998,29:120-128.2 BianH.FournierP,PeetersB.etal.Tumor-targetedgenetransferinvivoviarecombinantNewcastlediseasevirusmodifiedbyabispecificfusionprotein

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