兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)法

1、兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)法 軟骨包括骨骺軟骨和關(guān)節(jié)軟骨，是由軟骨細(xì)胞及其軟骨基質(zhì)構(gòu)成的。軟骨能揚(yáng)骨骼之彈性和韌性之長(zhǎng)，避骨骼之脆性之短，降低運(yùn)動(dòng)中骨與骨之間的摩擦，并具有減震作用。軟骨與骨不同，軟骨不含血管和神經(jīng)，細(xì)胞又包埋于軟骨陷窩里，是較易獲得的均一軟骨細(xì)胞。軟骨基質(zhì)是由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的，主要由ii型膠原和蛋白多糖組成。軟骨細(xì)胞埋藏于致密的糖蛋白軟骨基質(zhì)中，必需經(jīng)過一系列酶消化才干獲得少量軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)也較困難。從軟骨組織的選材、軟骨細(xì)胞的分別消化和培養(yǎng)，尤其是在傳代培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞的功能會(huì)逐漸削弱和消逝。 【材料】 1組織來(lái)源未成年兔的膝關(guān)節(jié)。 2培養(yǎng)用液 famf12 培養(yǎng)液加入15% fbs

2、,2.3mmo1/l mgc12,100u/ml、100ug/ml，ph 7.6。 3. gey平衡鹽溶液（gbss, ph 7.0)，加入100u/ml、100 ug/ml、100ug/ml制霉菌素。 4消化液及其他用液 0.2溶液（溶于gbss) ,0.5%睪丸透亮質(zhì)酸酶（溶于gbss) , 0.25%胰蛋白酶溶液（溶于gbss)，過濾除菌，冰箱凍存?zhèn)溆茫?.125溶液，用不含ca2+和mg2+的cmf-pbs液配制，過濾除菌，冰箱凍存?zhèn)溆茫宦樽碛靡骸?5器具等手術(shù)用刀、剪、鑷，平皿、25 ml旋口試管、200目濾網(wǎng)等。 【辦法】 1取材用麻醉兔，將未成年免胸部用脫毛劑脫毛，用、消毒，移至

3、試驗(yàn)臺(tái)上，開胸取1段肋軟骨及骨移行部（圖4-10)，浸泡于gbss液中洗滌，移肋軟骨于解剖板上，去除周圍大部分軟組織，用鑷子夾持骨側(cè)，用刀由骨側(cè)向軟骨側(cè)剝離軟組織，分別骨及軟骨片（圖4-10a)，浸泡于新gbss液中，最后分別出所有的骨與軟骨片，于操作板上切開骨與軟骨的連結(jié)部，切取近骨端側(cè)一段略為透亮的軟骨部分（長(zhǎng)約23mm)，集中含生長(zhǎng)軟骨，余下的是靜止軟骨與透亮軟骨（圖4-10b)；另外，也可以取膝關(guān)節(jié)處的軟骨。先用、消毒兔后肢膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀從關(guān)節(jié)表面削下呈乳白淺藍(lán)色、半透亮狀略帶彈性的軟骨組織片，收集在含有g(shù)bss液的無(wú)菌平皿中。除去軟骨表面的血液和殘存的滑膜組織，反復(fù)清洗整潔；將肋軟

4、骨或膝關(guān)節(jié)軟骨組織片移入另一平皿內(nèi)用剪刀將軟骨充分剪成（12) mm3大小的組織塊，用gbss清洗2次。 2透亮質(zhì)酸酶消化分別軟骨細(xì)胞收集所有切碎的軟骨，除去gbss，加入4ml透亮質(zhì)酸酶，室溫下作用5分鐘，除去透亮質(zhì)酸酶，另外加入8ml新奇的于室溫下作用10分鐘，除去透亮質(zhì)酸酶，用5ml gbss清洗組織碎塊2次，然后移入25 ml旋口試管中。 3胰蛋白酶消化分別軟骨細(xì)胞去除gbss液，分離用2ml 0.25胰蛋白酶溶液洗軟骨碎塊2次，去除用過的胰蛋白酶洗液，再加新奇的胰蛋白酶4ml，置37水浴中輕微振蕩消化30分鐘。去除胰蛋白酶，用gbss清洗2次，每次用5m1, 4膠原酶消化分別軟骨細(xì)胞

5、用0.2膠原酶ii溶液2ml清洗5分鐘，去除膠原酶洗液，加入4 ml 0.2膠原酶ii溶液，置37水浴中消化30分鐘，去除上清液。加入4ml膠原酶ii溶液，置37水浴中消化90分鐘。 5收集上清液以1500r/min離心8分鐘，收集細(xì)胞團(tuán)，將細(xì)胞懸浮于8ml含有15胎牛血清的f12培養(yǎng)液中，以500r/min離心1分鐘，將上清液移入另一試管，以去除未消化的軟骨基質(zhì)。 6軟骨細(xì)胞培養(yǎng)將收集的上清液以1500r/min離心10分鐘，收集細(xì)胞用含有15胎牛血清的f12培養(yǎng)液再懸浮。按照細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（110)x105個(gè)ml，接種培養(yǎng)瓶，置于37,5% c02、飽和濕度的c02孵箱中培養(yǎng)，每

6、2天換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后即可傳代。 7軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)取長(zhǎng)滿瓶壁的軟骨細(xì)胞瓶，倒掉培養(yǎng)液，再用培養(yǎng)液輕輕漂洗1次貼壁的細(xì)胞，加入 0.125蓋過細(xì)胞，置37下消化，當(dāng)貼壁細(xì)胞表面含糊，鏡下見細(xì)胞變圓時(shí)，當(dāng)心傾出胰酶液，加入培養(yǎng)液后用吸管吹打簇?fù)砑?xì)胞，按1分2分裝培養(yǎng)瓶，補(bǔ)齊培養(yǎng)液后置37,5% c02孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 【結(jié)果】 1原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞消化分別的軟骨細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶，于10h左右開頭貼壁，在倒置顯微鏡下觀看，剛接種時(shí)的細(xì)胞為圓形，貼壁細(xì)胞開頭生長(zhǎng)、分裂增殖，待匯集成片時(shí)，細(xì)胞呈圓形、卵圓形和多角形，很像上皮樣細(xì)胞（圖4-11)，可形成具有折光行的細(xì)胞外基質(zhì)。 2傳代培養(yǎng)的軟

7、骨細(xì)胞原代細(xì)胞經(jīng)消化后傳代培養(yǎng)，細(xì)胞可在610h貼壁，鏡下見細(xì)胞形態(tài)從圓形變?yōu)槎嘟切?，?xì)胞外基質(zhì)增多，具有折光性。細(xì)胞傳代至第3代以后，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，常見到分裂態(tài)的細(xì)胞；從傳至第4代開頭，多角形細(xì)胞逐漸變?yōu)樗笮危虺衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞改變。軟骨細(xì)胞傳至第6代以后，細(xì)胞形態(tài)則以梭形為主，但細(xì)胞的生長(zhǎng)活性開頭下降，分裂象細(xì)胞很少見，增生性活動(dòng)幾乎處于停頓。 3軟骨細(xì)胞的鑒定軟骨細(xì)胞的特征性分泌產(chǎn)物是酸性糖氨多糖，、和x型膠原等軟骨基質(zhì)，其中，酸性糖氨多糖可用組化法鑒定，即藍(lán)染色成藍(lán)染；分泌的,和x型膠原等可用已知的相應(yīng)抗體舉行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以呈陽(yáng)性免疫染色反應(yīng)來(lái)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是否具有軟骨細(xì)胞的生物學(xué)

8、特性。 【注重事項(xiàng)】 1軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)較困難，尤其是細(xì)胞的分別過程，從軟骨組織塊的充分剪切，用透亮質(zhì)酸酶、和膠原酶消化兩遍以去除基質(zhì)，再用膠原酶長(zhǎng)時(shí)光消化，到控制消化反應(yīng)溫度和消化過程中輕微的振蕩等，均有助于基質(zhì)的分解與軟骨細(xì)胞的分別。 2分別軟骨細(xì)胞可采納不同的消化液，膠原酶效果較好，可用于原代培養(yǎng)時(shí)消化軟骨組織塊的消化；胰蛋白酶也可用于軟骨細(xì)胞的消化，主要用于傳代細(xì)胞的分別。 3軟骨細(xì)胞在呈弱堿性并增強(qiáng)mg2+濃度的培養(yǎng)基中易于生長(zhǎng)，故挑選弱堿性的f12培養(yǎng)液并增添加mgcl2。普通只培養(yǎng)34代，培養(yǎng)3代以內(nèi)的細(xì)胞仍可保持軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，若再繼續(xù)傳代，軟骨細(xì)胞會(huì)逐漸失去其特異性表型，發(fā)生