六種特定多環(huán)芳烴高效液相色譜法（A)

1、六種特定多環(huán)芳烴高效液相色譜法（a) 1辦法原理 本辦法用環(huán)己烷萃取水中多環(huán)芳烴（pah ),萃取液通過佛羅里硅土柱，pah被吸附在柱上，用丙酮與二氯甲烷的混合溶劑洗脫pah，之后用具熒光或紫外檢測器的高效液相色譜儀測定。本辦法對六種pah通?？蓹z測到ng/l水平。 2.辦法的適用范圍 本辦法適用于飲用水、地下水、湖庫水、河水及焦化廠和油氈廠的工業(yè)污水中熒蒽、苯并b熒蒽、苯并k熒蒽、苯并a芘、苯并ghi苝、茚并1, 2, 3-cd花等六種多環(huán)芳烴的測定。 3干擾及消退 水樣中若存在可被共萃取并能產(chǎn)生熒光信號或熄滅熒光的物質(zhì)對本法也有干擾。本法用佛羅里硅土柱層析凈化分別，可降低熒光背景。 4儀器

2、 1)高效液相色譜儀：具熒光和紫外檢測器的高效液相色譜儀。 恒流梯度泵系統(tǒng)。 反相柱：填料為zorbax 5ods，柱長250mm，內(nèi)徑4.6mm。 熒光檢測器：熒光分光光度計檢測器，激發(fā)波長280nm，放射光波長（即測量波長）大于389nm截止點；熒光光度計檢測器應(yīng)有激發(fā)用的色散光系統(tǒng)和可用濾光片或色散光學系統(tǒng)的熒光放射部分。 紫外一可見光檢測器：可調(diào)波長紫外檢測器或固定波長254nm的紫外檢測器，可單獨用法，也可以與熒光檢測器聯(lián)用。 記錄儀：與檢測器匹配。 微量注射器：5、10、50、100、500l。 恒溫水?。ɑ蚝銣刂洌?。 2）采樣瓶：1l具磨口玻璃塞的棕色玻璃細口瓶。 3) 振蕩器

3、：調(diào)速，配備自動間歇延時控制儀。 4）玻璃器皿： 分液漏斗：l000nml，玻璃活塞不要涂潤滑油。 碘量瓶：200m1。 層析柱：凈化環(huán)己烷層析柱：長500mm，內(nèi)徑25mm，玻璃活塞不涂潤滑油的玻璃柱。 樣品預(yù)處理層析柱：長250mm，內(nèi)徑l0mm，玻璃活塞不涂潤滑油的玻璃柱。 k-d濃縮瓶：25m1，具刻度，容積必需舉行標定，具磨口玻璃塞。 k-d蒸發(fā)瓶：500m1。 k-d snyder柱：三球，常量。 k-d snyder柱：二球，微量。 量筒：500m1。 5）玻璃棉或玻璃纖維濾紙：在400加熱1h。冷卻后，保存在具磨口塞的玻璃瓶中。 6）沸石：在100加熱lh。冷卻后，保存在具磨口

4、塞的玻璃瓶中。 5試劑 1) 高效液相色譜流淌相為水和甲醇的混合溶液。 甲醇：hplc分析純。 純水：電滲析水或蒸餾水，加高錳酸鉀在堿性條件下重蒸。在測定的化合物檢測波特長未觀看到干擾。 2)二氯甲烷：優(yōu)級純，用全玻璃蒸餾器重蒸餾，在測定化合物檢測波特長不浮現(xiàn)色譜干擾為合格。 3）丙酮：同上。 4）環(huán)己烷：同上。 5)無水硫酸鈉：分析純，在400加熱2h. 6）硫代硫酸鈉（na2s2o35h2o)：分析純。 7)佛羅里硅土（florisil) : 60-100目，色層分析用。在400加熱2h。冷卻后，用純水調(diào)至含水量為11%。 8) 堿性氧化鋁：層析用，50-200m，活度為brockmann

5、 i級。達到i級的制備辦法如下： 將氧化鋁加熱至55020起碼2h，冷卻至200-250，移入放有高氯酸鎂的干燥器內(nèi)，繼續(xù)冷卻，即得活度為brockmann i級的氧化鋁。在干燥器內(nèi)可存放5d。 9)硅膠：柱層析用，100目，在300干燥4h。 10）濃硫酸：優(yōu)級純。 11)色譜標準物：固體多環(huán)芳烴標準物為熒蔥、苯并k熒蒽、苯并b熒蒽、苯并a芘、茚并1, 2, 3-cd芘及苯并ghi苝等六種，純度在以上。采納固體標準物配制標準貯備液，亦可采納經(jīng)證明為合格的市售多環(huán)芳烴標準溶液配置標準貯備液。 12）用固體多環(huán)芳烴配制標準貯備液：分離稱量各種多環(huán)芳烴20mg0.lmg，分離溶解于50-70ml環(huán)

6、己烷中，再以環(huán)己烷稀釋至100m1，配成濃度為200g/ml單個化合物的標準貯備液。若用市售溶液配制標準貯備液，可在容量瓶中用環(huán)己烷稀釋，使標準貯備液的濃度各為200g/ml的單化合物溶液。貯備液保存在4冰箱中。 13)混合多環(huán)芳烴標準溶液的配制：在l 0ml容量瓶中加入各種pah貯備液lml0.0lml，用甲醇稀釋至標線，使標準溶液中各種多環(huán)芳烴的濃度為20g/ml。標準液保存于4冰箱中。 14）標準工作溶液：按照儀器敏捷度及線性范圍的要求，取不同量的混合多環(huán)芳烴標準溶液，用甲醇稀釋，配制成幾種不同濃度的標準工作溶液。 注重：有些多環(huán)芳烴是強致癌物，因此操作時必需極其當心。不允許人體與多環(huán)芳

7、烴固體物質(zhì)、溶劑萃取物、多環(huán)芳烴標準品接觸。多環(huán)芳烴可隨溶劑一起揮發(fā)而沾附于具塞瓶子的外部，因此處理含多環(huán)芳烴的容器及試驗操作過程必需用法抗溶劑的手套。被多環(huán)芳烴污染的容器可用紫外燈在360nm紫外線下檢查，并置于重鉻酸鉀一濃硫酸洗液中浸泡4h。標準溶液應(yīng)在有適當設(shè)備（如合適的毒氣櫥、防護衣服、防塵面罩等）的試驗室中配制。用固體化合物配多環(huán)芳烴標準品，在沒有合適的平安設(shè)備及尚未正確把握用法技術(shù)之前，不能舉行。 6步驟 (1)水樣的采集與保存 樣品必需采集在玻璃容器中，采樣前不能用水樣預(yù)洗瓶子，以防止樣品的沾染或吸附。防止采集表層水，保證所采樣品具有代表性。在采樣點采樣及蓋好瓶塞時，樣品瓶要徹低

8、注滿，不留空氣。若水中有殘余氯存在，要在每升水中加入80mg硫代硫酸鈉除氯。水樣應(yīng)放在暗處，在4冰箱中保存；采樣后應(yīng)盡快在24h內(nèi)舉行萃取。萃取后的樣品在40d內(nèi)分析完畢。 (2）水樣萃取 搖勻水樣，用500m1量筒量取500m水樣（萃取所用水樣體積視詳細狀況而定，可增減），加入50ml環(huán)己烷，手搖分液漏斗，放氣幾次后，安裝分液漏斗于振蕩器架上，振搖5min舉行萃取。取下分液漏斗，靜置約15-30min（靜置時光視兩相分開狀況而定），分出下層水相留待舉行其次次萃取，上層環(huán)己烷相放入200m1碘量瓶中，再用50m1環(huán)己烷對水樣舉行其次次萃取，水相棄去，環(huán)己烷萃取液并入同一碘量瓶中，加無水硫酸鈉至

9、環(huán)己烷萃取液清亮，起碼放置30min，脫水干燥。 (3)萃取液的凈化 飲用水的環(huán)己烷萃取液可以不經(jīng)柱層析凈化，濃縮后挺直舉行hplc分析。地表水及工業(yè)污水環(huán)己烷萃取液的凈化： 層析柱的裝填：在玻璃層析柱的下端，放入少量玻璃棉或玻璃纖維濾紙以支托填料，加入3m1環(huán)己烷潤濕柱子。稱4-6g佛羅里硅土于小燒杯中，用環(huán)己烷制成均漿，以濕式裝柱法填入上述柱中。凈化地表水的柱內(nèi)填充4g佛羅里硅土；凈化污水的柱，填充6g佛羅里硅土。放出柱中過量的環(huán)己烷至填料的界面。 萃取液的凈化：從層析柱的上端加入已脫水的環(huán)己烷萃取液，所有溶液以1-2ml/min流速通過層析柱，用環(huán)己烷洗滌碘量瓶中的無水硫酸鈉三次，每次（

10、(5-10)而，環(huán)己烷洗滌液亦加入到層析柱上，回收通過柱的環(huán)己烷。被吸附在柱上的pah用丙酮和二氯甲烷的混合溶液洗脫。地表水用100m1 (88m1丙酮+12m1二氯甲烷）洗脫；污水用75m1 (15m1丙酮+60ml二氯甲烷）洗脫。洗脫液收集于己聯(lián)接k-d蒸發(fā)瓶的k-d濃縮瓶中，加入兩粒沸石，安裝好三球snyder柱待濃縮。 (4）樣品的濃縮 將k-d濃縮裝置的下端浸入通風櫥中的水浴鍋中，在65-70的水溫下濃縮至約0.5m1，從水浴鍋上移下k-d濃縮裝置，冷卻至室溫，取下三球snyder柱，用少量丙酮洗柱及其玻璃接口，洗滌液流入濃縮瓶中。加入一粒新沸石，裝上二球snyder柱，在水浴鍋中如

11、上述濃縮至0.3.0.5ml，留待hplc分析。 注：甲醇、環(huán)己烷、二氯甲烷及丙酮等易燃有機溶劑，應(yīng)在通用櫥中操作。 (5) hplc分析條件 柱溫：35。 流淌相組成：a泵：85水+15甲醇；b泵：100甲醇。 洗脫：視色譜柱的性能可采納恒溶劑洗脫，即以92% b泵和8% a泵流淌相組成，等濃度洗脫。梯度洗脫，即以60% b泵+40% a泵的組成洗脫，保持20min；以3% b/min增量至成為% b+4% a泵的組成，保持至出峰完；以8% b/min減量至成為60%b泵40%a泵的組成，保持15min，使流淌相組成恒定，為下一次進樣預(yù)備好條件。 流淌相流量：30ml/h恒流或按柱性能選定流

12、量。 檢測器波長的挑選：六種多環(huán)芳烴在熒光分光光度計特定條件下最佳的激發(fā)和放射波長。水樣中含茚并1, 2, 3-cd芘時選ex= 340nm, em=450nm較好，在此波長下茚并1, 2, 3-cd芘的熒光強度較高；否則選ex= 286nm, em=430nm對苯并a芘敏捷度較高。 熒光計檢測器：單色光熒光計用法ex 300nm, em=460nm為相宜；濾光器熒光計在ex 300nm, em 370nm下測定。 紫外檢測器：在254nm下檢測pah。 進樣方式：以注射器人工進樣（或采納自動進樣器進樣）；進樣量：5-25l。 定性分析：化合物在不同填料的色譜柱上出峰挨次有所不同，下圖為兩種不

13、同檢測器串聯(lián)的16種pahs標準色譜圖。圖4-4-23為紫外檢測器在波長254nm下的色譜圖；圖4-4-24為熒光檢測器在ex 286mn, em=430nm下的色譜圖。多環(huán)芳烴標樣各化合物濃度為2g/ml，進樣量10l。各組分的出峰次序為：1.萘，2.二氫苊，3.苊芴，4.菲，5.蒽，6.熒蒽，7.芘，8.苯并a蒽枹，9.苯并b熒蒽，10苯并k熒蒽，11苯并a芘，12二苯并a, h蒽，13苯并ghi芘，14.茚并1, 2, 3-cd芘。以試樣的保留時光和標樣的保留時光相比較來定性。用作定性的保留時光窗口寬度以當天測定標樣的實際保留時光變幻為基準。用一個化合物保留時光標準偏差的三倍計算設(shè)定的窗口寬度。 定量分析：用外標法定量，在線性范圍內(nèi)用混合par標準溶液配制幾種不同濃度的標準溶液，其中最低濃度應(yīng)稍高于最低檢測限。 11.hplc中用法標準樣品的條件：標準樣品與樣品進樣體積最好相同，兩者的響應(yīng)值也要相近；在工作范圍內(nèi)，相對標準偏差10%；標準樣品與試樣應(yīng)盡可能同時舉行分析。 12.每個工作日必需測定一種或幾種濃度的標準溶液來檢驗校準曲線或響應(yīng)因子。假如某一化合物的響應(yīng)值與標準值間的偏差大于10%，則必需用新的標準對該化合物繪制新的校準曲線或求出新的響應(yīng)因子。 7計算 用外標法計算試樣中的濃度。 xi=ai