緩沖溶液的配制

1、緩沖溶液緩沖溶液是一類能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持 pH值基本不變的溶液。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作 用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶 液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配 比即可制得不同pH的緩沖液。緩沖溶液的正確配制和pH值的準確測定，在生物化學的研究工 作中有著極為重要的意義，因為在生物體內(nèi)進行的各種生物化學過程 都是在精確的pH值下進行的，而且受到氫離子濃度的嚴格調(diào)控，能 夠做到這一點是因為生物體內(nèi)有完善的天然緩沖系統(tǒng)。生物體內(nèi)細胞 的生長和活動需要一定的pH值，體內(nèi)pH環(huán)境的任何改變都將引起 與代謝有關(guān)的酸

2、堿電離平衡移動，從而影響生物體內(nèi)細胞的活性。為 了在實驗室條件下準確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外 生物化學反應過程有體內(nèi)過程完全相同的pH值，此外，各種生化樣 品的分離純化和分析鑒定，也必須選用合適的pH值，因此，在生物 化學的各種研究工作中和生物技術(shù)的各種開發(fā)工作中，深刻地了解各 種緩沖試劑的性質(zhì)，準確恰當?shù)剡x擇和配制各種緩沖溶液，精確地測 定溶液的pH值，就是非常重要的基礎實驗工作。下表列出某些人體 體液的pH值：表13人體體液pH體液PH體液PH血清7.357.45大腸液8.3 8.4成人胃液().9 1.5淚6.6 6.9唾液6.3 7.1尿4.8 7.5胰液7.5 8.(

3、)腦脊液7.357.457.1基本概念（1） Br6nstcd-Lowry酸堿理論（又稱酸堿質(zhì)子理論）。1923年由丹 麥化學家JN.BrSnstcd和英國化學家T.M.Lowry同時提出了酸堿質(zhì)子學說，發(fā)展了酸堿理論，被后人稱為酸堿質(zhì)子理論或Br6nstcd-Lowry 酸堿理論。他們認為凡能釋放質(zhì)子的分子或離子(如：H2(), HC1, nh4+, hso4-等)稱為酸，凡能接受質(zhì)子的分子或離子(如：h2o, nh3, c等)稱為堿。因此，一種酸釋放質(zhì)子后即成為堿，稱為該 酸的共癰堿，同樣一種堿與質(zhì)子結(jié)合后，形成對應的酸，稱為該堿的 共物酸。AH + B-A + BH工酸I 堿2堿I 酸2

4、酸I是堿I的共軻酸，堿2是酸2的共朝堿。如鹽酸在水中的解離：HC1+ H-HQ是酸，cr是它的共物堿。緩沖體系的設計：強電解質(zhì)溶于水幾乎全部解離為正負離子，弱電解質(zhì)溶于水時， 則不完全解離，只有部分的分子解離出正負離子，其馀以分子形式存 在于溶液中。例如弱酸(HA)及其鹽溶于水時，只有部分HA解離 為H+和A-離子，其平衡方程式如下：KiHA XA + H+(1-1)IHAlgH - = - lg K + 1g 一 。-2)式兩邊取負對數(shù)：'"I(1-3)(1-3)式中：HA一為弱酸的濃度Hl 為HA解離出的氫離子濃度AH 為HA的共物堿的離子濃度K.一為酸解離的速度常數(shù)七一

5、為A與H+締合的速度常數(shù)Ka 一為反應方程(1-1)達平衡時HA的解離平衡?，F(xiàn)將HA的pKa定義為一1g Kq將HA溶液的pH定義為一 logtH4,(1-3)式可寫為:或:P” = P(+lg離解形式未離解形式。-4)(1-5)方程(1-4)稱為：Hcndcrson-HassdBalch方程，此方程對于生物化 學學科，在理論與實踐上都具有重要意義。該方程表示了溶液pH與 溶質(zhì)中可解離基團PK之間的關(guān)系。很明顯，當A- = HA時：pH = pK.這就意味著當HA有一半解離時，溶液的pH等于pK，此弱酸 堿緩沖體系的pKa即代表緩沖范圍的中點。一個緩沖體系的有效緩 沖范圍，通常是在PK,值為中

6、點的兩個pH單位范圍內(nèi)，即：緩沖劑 的有效pH范圍=pK.±l,所以，當緩沖溶液的pH等于該緩沖劑的 PW時，緩沖能力最大。若要設計一個新的緩沖體系時，只需按所要 求的pH值查出pKj值等于此pH值的各種緩沖劑并從中進行挑選即 可。I960年，N.E.Gwd和他的同事們提出，適合生命科學研究使用的 緩沖體系應具有以下特性：pK*值在68之間；在水中的溶解度高；不易穿透 生物膜；鹽效應??；離子濃度、溶液組成和溫度對解離的影響 ??；不與金屬離子生成復合物或沉淀；該緩沖劑化學穩(wěn)定； 紫外和可見光波長范圍內(nèi)光吸收??；易制得高純度的鹽。按照這些要求可以設計和選擇最為合適的緩沖劑來配制所需的 緩

7、沖溶液。7.2生物化學常用緩沖液磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由於它們是 二級解離，有二個pK“值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬:NaH2P()4： pK“1 = 2.12, pl<a2 = 7.21Na2HP()4:pK.1 = 7.21, pl<a2= 12.32配酸性緩沖液：用 NaH2PO4, pH = l4,配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH = 68,配堿性緩沖液：用 Na2HPO4, pH = l()-12o用鉀鹽比鈉鹽好，因為低溫時鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，但若配制 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時，只能用磷酸鈉而不能用磷酸 鉀

8、，因為SDS (十二烷基硫酸鈉)會與鉀鹽生成難溶的十二烷基硫酸 鉀。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為：容易配制成各種濃度的緩沖液；適 用的pH范圍寬;pH受溫度的影響小;緩沖液稀釋后pH變化小, 如稀釋十倍后pH的變化小于0.1 o其缺點為：易與常見的鈣GT+商子、鎂Mg+離子以及重金屬 離子締合生成沉淀；會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化 作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。Tris (三羥甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethanc) 緩沖液Tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，有超過磷酸鹽緩 沖液的趨勢，如在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中已都使用Tris緩沖

9、液, 而很少再用磷酸鹽。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性”范圍，例如：Tris-HCl 緩沖液：pH = 7.5 8.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH = 5.()9.()配制常用的緩沖液的方法有兩種：按書后附錄中所列該緩沖液 表中的方法,分別配制0.05mol/LTris和0.05mol/L HC1溶液,然后按 表中所列體積混合。由于標準濃度的稀鹽酸不易配制，所以常用另一 種方法；若配IL O.lmol/L的Tris-HCl緩沖液：先稱12.11g Tris 堿溶于950mL97()mL無離子水中，邊攪拌邊滴加4N HC1,用pH 計測定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水補足到1U

10、Tris-HCl緩沖液的優(yōu)點是：因為Tris堿的堿性較強，所以可 以只用這一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的 緩沖液；對生物化學過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子 發(fā)生沉淀。其缺點是：緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋 十倍，pH值的變化大于0.1;溫度效應大，溫度變化對緩沖液pH 值的影響很大，即：pKa/ =-0.031 ,例如：4時緩沖液的pH = 8.4,則37時的 pH = 7.4,所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl 緩沖液不能用于。4 o易吸收空氣中的C()2,所以配制的緩 沖液要蓋嚴密封。此緩沖液對某些pH電極發(fā)生一定的

11、干擾作用， 所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。有機酸緩沖液這一類緩沖液多數(shù)是用痰酸與它們的鹽配制而成，pH范圍為酸 性，即pH = 3.()6.(),最常用的是甲酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等。甲酸甲酸鹽緩沖液很有用，因其揮發(fā)性強，使用后可以用減壓 法除之。乙酸乙酸鈉和檸檬酸檸檬酸鈉緩沖體系也使用的較多， 檸檬酸有三個pKj直：pKal = 3.10,PK,2 = 4.75, pKa3=6.40。琥珀酸有二個 pKj值：pl<:11 = 4.18, pK;l2 = 5.60。有機酸緩沖液的缺點是：所有這些酸酸都是天然的代謝產(chǎn)物， 因而對生化反應過程可能發(fā)生干擾作用；檸檬酸鹽和琥珀酸鹽

12、可以 和過渡金屬離子(F"+、Zn' Mg+等)結(jié)合而使緩沖液受到干擾； 這類緩沖液易與C/+離子結(jié)合，所以樣品中有CG-離子時，不能 用這類緩沖液。(4)硼酸鹽緩沖液常用的有效pH范圍是：pH = 8.510.0,因而它是堿性范圍內(nèi)最 常用的緩沖液，其優(yōu)點是配制方便，只使用一種試劑，缺點是能與很 多代謝產(chǎn)物形成結(jié)合物，尤其是能與糖類的羥基反應生成穩(wěn)定的復合 物而使緩沖液受到干擾。氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于pH=2.()11.(),例如最常用的有: 甘氨酸一HC1緩沖液:pH=2.()5.(),甘氨酸一NaOH緩沖液：pH=8.()11.(),甘氨酸一Tris緩

13、沖液：pH=8.()11.0,(此緩沖液用于廣泛使用的 SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液)，組氨酸緩沖液：pH=5.56.5,甘氨酰胺(glycine amide)緩沖液：pH=7.88.8, 甘氨酰甘氨酸(glycylglycinc)緩沖液：pH=8.()9.()。此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組份和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點是：與叛酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾 某些生物化學反應過程，如代謝過程等。試劑的價格較高。(6)兩性離子緩沖液(Zwitterionic buffers),又稱Good' s緩沖液I960年，N.EGood和他的同事們總結(jié)了現(xiàn)有的各種緩沖試

14、劑的優(yōu) 缺點后認為，必須用人為設計和人工合成的方法來找到專門用于生命 科學研究的特定的緩沖體系，這些緩沖體系應具有前面所述的九條要 求和特性。他們合成的一系列Good' s緩沖液可查閱有關(guān)的資料。Good' s緩沖液的主要優(yōu)點是不參加和不干擾生物化學反應過 程，對酶化學反應等無抑制作用，所以它們專門用于細胞器和極易變 性的、對pH敏感的蛋白質(zhì)和酶的研究工作。其缺點是：價格昂貴, 對測定蛋白質(zhì)含量的雙縮月尿法和Lowry法不適用，因為它們會使空 白管的顏色加深。常用緩沖溶液的配制方法1.甘氨酸-鹽酸緩沖液(0.05mol/L)X毫升0.2 mol/L甘氨酸+Y毫升0.2 mol/

15、L HCI,再加水稀釋至200亳升PHXY嚴Y2.05044.03.05011.42.45032.43.2508.22.6502423.4506.42.85016.8505.0甘氨酸分子星=75.07, 0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。2.鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液(0.05 mol/L)X毫升0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫姆+ 0.2 mol/L HC1,再加水稀釋到20亳升pH(20t)XYpH(20)Y2.2一 34.0703.251.4702.4一 33.9603.450.9902.6一 33.2953.650.5972.8.2.6423.850.2633.0 32.022

16、鄰苯二甲酸氫鉀分于呈=204.23, 0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫溶液含40.85克/升3.磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH0.2mol/LNa2HPO4 (毫升)0.1 mol/L 檸檬酸(毫升)盧0.2mol/LNa2HPO4 (毫升)0.1 mol/L檸檬酸 (亳升)2.20.4010.605.210.729.282.41.2418.765.411.158.852.62.1817.825.611.608.402.83.1716.835.812.097.913.04.1115.896.012.637.373.24.9415.066.213.226.783.45.7014.306.413.85

17、6.153.66.4413.566.614.555.453.87.1012.906.815.454.554.07.7112.297.016.473.534.28.2811.727.217.392.614.48.8211.187.418.171.834.69.3510.657.618.731.274.89.8610.147.819.150.855.010.309.708.019.450.55Na2Hp(L 分于曷=14.98, 0.2 mol/L 溶液為 28.40 克/升。Na2HPO4 - 2H2。分子量=178.05, 0.2 mol/L 溶液含 35.01 克/升。C4H2O7 , H2

18、O 分子曷=210.14, 0.1 mol/L 溶液為 21.01 克/升。4.檸檬酸-氫氧化鈉鹽酸級沖液PH衲高于濃度 （mol/L）檸檬酸（克）QHQl h2o氫氧化鈉而 NaOH97%鹽酸（毫升）HC1 （濃）最終體積 （升）2.20.2021084160103.10.2021083116103.30.2021083106104.30.202108345105.30.3524514468105.80.45285186105106.50.3826615612610使用時可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有變化，再用少提50%氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調(diào)節(jié)，冰箱保存。5.檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（

19、0.1 mol/L）PH0.1 mol/L 檸檬酸 （毫升）0.1 mol/L檸檬酸鈉 （毫升）問0.1 mol/L 檸檬酸（毫升）0.1 mol/L檸檬酸鈉 （毫升）3.018.61.45.08.211.83.217.22.85.27.312.73.416.04.05.46.413.63.614.95.15.65.514.53.814.06.05.84.715.34.013.16.96.03.816.24.212.37.76.22.817.24.411.48.66.42.018.04.610.39.76.61.418.64.89.210.8檸檬酸C6HbO7,H2O:分子呈210.14, 0

20、.1 mol/L溶液為21.01克/升。檸檬酸鈉Na.品HQ-2H2O:分亍盤294.12 , 0.1 mol/L溶液為29.41克/毫升。6.乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)pH（18t）0.2 mol/LNa Ac （亳升）0.3 mol/LHAc（毫升）pH（18）0.2 mol/LNaAc （毫升）0.3 mol/L HAc （毫升）2.60.759.254.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.9（）2.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.

21、89.4（）0.60Na2Ac - 3Hq 分子星=136.09, 0.2 mol/L 溶液為 27.22 克/升。7 .磷酸鹽級沖液(0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉諼沖液(0.2)pH0.2 mol/LNa2HPO4 （毫升）0.3 mol/LNaH2P（L （毫升）PH0.2 mol/LNa>HP（）4（毫升）0.3 mol/LNaH2P（L （毫升）5.88.092.07.061.039.05.910.090.07.167.033.06.012.387.77.272.028.06.115.085.07.377.023.06.218.581.57.481.019.06.322.577.57

22、.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.568.57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.08.094.75.36.955.045.0Na2HPO4 - 2H2。分亍量=178.05, 0.2 mol/L 溶液為 85.61 克/升。NazHPQ4 72H2。分子曷=358.22, 0.2 mol/L 溶液為 71.64 克/升。NaHzPCU 2H2。分子=156.03, 0.2mol/L 溶液為 31.21 克/升。(2)磷酸氫二鈉-磷酸二氫神諼沖液(l/15mol/L

23、)PHmol/L/15Na2HPO4（毫升）mol/L/15KH2P（毫升）PHmol/L/15Na2HP（毫升）mol/L/15KH2P。4（毫升）4.920.109.907.177.003.005.290.509.507.388.002.005.911.009.0()7.739.001.006.242.008.0()8.049.500.506.473.007.008349.750.256.644.006.008.679.900.106.815.005.008.1810.0006.986.004.00Na2HPO4 - 2H2O 分子最=178.05, 1/15M 溶液為 11.876 克/

24、升。KH2PO4 分子曷=136.09, 1/15M 溶液為 9.078 克/升。8 .磷酸二氯鉀-氫氧化鈉級沖液（0Q5M）X毫升0.2M K2P（L+ Y毫升0.2N NaOH加水稀釋至29毫升pH(20t)X（毫升）Y （毫升）pH(20)X（毫升）Y （毫升）5.80.3727.052.9636.00.5707.253.5006.2一 30.8607.453.9506.4一1.2607.654.2806.6.1.7807.854.5206.8.32.3658.054.6809 .巴比妥鈉鹽酸緩沖液（18*C）PH0.04M巴比妥 鈉溶液0.2V鹽酸pH0.04M巴比妥 鈉溶液（毫升）0

25、.2N鹽酸（毫 升）6.810018.48.41005.217.010017.88.61003.827.210016.78.81002.527.410015.39.01001.657.610013.49.21001.137.810011.479.41000.708.01009.399.61000.358.21007.21100巴比妥鈉鹽分子曷=206.18;0.04M溶液為8.25克/升10. Tris-鹽酸緩沖液（0.05M, 25-C）50亳升0.1M三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與X毫升0.1 N鹽酸混勻后，加水稀釋至100毫 升。PHX（毫升）PHX（亳升）7.1045.78.102

26、6.27.2044.78.2022.97.3043.48.3019.97.4042.08.4017.27.5040.38.5014.77.6038.58.6012.47.7036.68.7010.37.807.908.()034.532.029.28.808.908.57.0三羥甲基氨基甲烷（Tris） HOCH2 CH2OHHOCH2 NH2分于呈=121.14；O.1M溶液為12.114克/升。Tris溶液可從空氣中吸收二氧化碳，使用時注意將瓶蓋嚴。11.硼酸-硼砂緩沖液（0.2M硼酸根）PH0.05M硼砂 （毫升）0.2M硼砂（毫 升）州0.05M硼砂 （毫升）0.2M硼酸（毫 升）7.

27、41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0硼砂Na2B4（）7,d0,分子星二38L43;0.05V溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。硼酸氏BO”分子量=6L84,0.2M溶液為12.37克/升。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。11.硼酸硼砂緩沖液（0.2M硼酸根）PH0.05M硼砂 （毫升）0.2M硼酸（毫 升）PH0.05M硼砂 （毫升）0.2M硼酸（毫 升）7.41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.

28、07.08.02.0硼砂N&BQi,10匕0,分子星=38L43;0.05M溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。硼酸H2BO3,分亍量=61.84, 0.2M溶液為12.37克/升。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。12.甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05M）X毫升0.2M甘氨酸+Y毫升0.2Nna（）H加水稀釋至200毫升陽XYPHY8.6504.09.65022.48.8506.09.85027.29.0508.810.05032.09.25012.010.45038.69.45016.810.65045.5甘氨酸分于最=75.07。2M溶液含15.01克/升。13.硼砂氫第化鈉級沖液（0.05M硼酸根）X亳升0.05M硼砂+Y毫升0.2NNa（）H加水稀釋至200毫升XYPHXY1.810.005.0235.09.1570.01.892.55.3337.59.3772.51.985.05.7240.09.6275.02.097.56.0942.59.9177.52.2110.06.3745.010.3880.02.3612.56.5947.510.8882.52.5615.06.850.011.285.02.871