金黃色葡萄球菌檢測方法

1、Revised as of 23 November 2020金黃色葡萄球菌檢測方法1 .紙片法目前廣泛應(yīng)用的一種方法，用紙片、膜、膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培 養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過觀察微生物在測試片上面的生長、顯色來測 定食品中微生物。采用快速測試片檢測具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：可測定少量檢品，不 需要配制試劑，不需要大量的玻璃器皿，操作簡便迅速；易于消毒保存，便于 運(yùn)輸攜帶方便，價格低廉；除紙片外無其他任何廢液廢物，大大減少了工作 量；可以在取樣時同時接種，結(jié)果更能反映.當(dāng)時樣本中真實(shí)細(xì)菌數(shù)，防止延長 接種時間時細(xì)菌繁殖造成的污染。技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單使用方便，避免了繁瑣的操作。技術(shù)缺點(diǎn)：

2、用時間比較長，無法準(zhǔn)確定性及計數(shù)。此方法現(xiàn)在應(yīng)用于快速檢測領(lǐng)域，美國3M公司Petrifilm為載體的測試片應(yīng)用 最為廣泛。但其也存在一些問題：Petrifilm測試片上覆蓋了一層薄膜，當(dāng)樣 品粘液過多時會出現(xiàn)菌落的擴(kuò)散和融合，影響計數(shù)；Petrifilm測試片面積較 小，當(dāng)菌量大于250cfu時，準(zhǔn)確計數(shù)較困難；待測樣品中含有的某些有機(jī)物可 能使顯色減緩。使目視效果下降，導(dǎo)致計數(shù)偏低。2 .免疫學(xué)方法各種免疫學(xué)方法的基本原理都是抗原抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng) 抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。金黃色葡萄球菌特異的抗原能激發(fā)機(jī)體產(chǎn) 生相應(yīng)的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測

3、金黃色前萄球菌 的特異抗原，也可利用金黃色葡萄球菌抗原檢測體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體，兩種方 法均能判斷機(jī)體的感染狀況。目前對于金黃色葡萄球菌的測定主要進(jìn)行了腸毒 素的測定，方法以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)為主，有膠體金方法，也有用親和素一生 物素乳膠凝集實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，但都有一定的局限性。免疫學(xué)方法包括下面兩個部分：（1）抗原抗體技術(shù)分析：抗原抗體技術(shù)是免疫技術(shù)中的核心部分，對于金黃色 葡萄球菌檢測全菌免疫篩選抗體是很困難的事情，現(xiàn)在目前市場有的大多都是 對金黃色葡萄球菌毒素類進(jìn)行免疫得到的抗體，金黃色葡萄球菌毒素有12種， 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)的金黃色葡萄球菌毒素A、B、C的抗體。毒素抗體優(yōu)勢在 于敏感度

4、高，易于檢查，缺點(diǎn)毒素種類多，檢測其中幾種不具有普遍性。毒素 分離工藝復(fù)雜，要得到純毒素成本比較高。（2）免疫學(xué)方法技術(shù)分析：上述免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用最多的是酶聯(lián)免疫技術(shù)和膠體 金側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)。酶聯(lián)免疫技術(shù)廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測，由于一次可以檢測多 個樣本，此技術(shù)多用于體外診斷，目前也廣泛用于食品安全。膠體金技術(shù)由于 操作簡單，檢測適度快等優(yōu)勢，在食品安全領(lǐng)域廣泛用于現(xiàn)場快速檢測。 基于免疫學(xué)方法的技術(shù)主要分為：酶聯(lián)免疫技術(shù)、膠體金側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)、免疫 熒光技術(shù)、免疫沉淀技術(shù)、乳膠凝集技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)。3 .分子生物學(xué)方法金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：腸毒素、 血漿凝固酶

5、、溶血素、殺白細(xì)胞素、表皮溶解毒素、毒性體克綜合重量毒素I 等。而這些致病因子基因的鑒定（包括耐藥性相關(guān)基因、毒素基因、酶基因及多種特異性鑒別基因）使得分子生物學(xué)檢測成為近年來應(yīng)用于食品中致病微生物快 速檢測的方法?；诜肿由飳W(xué)方法的技術(shù)主要分為：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)和實(shí)時熒光定 量PCR （rtPCR）技術(shù)、生物芯片技術(shù)、測序技術(shù)。分子生物學(xué)檢測技術(shù)是檢測技術(shù)的發(fā)展方向，是檢測技術(shù)的未來，從DA、RNA 角度深度檢測。但是由于檢測方法復(fù)雜，需要儀器設(shè)備及專業(yè)人員操作，對實(shí) 驗(yàn)室環(huán)境有要求，檢測成本高等因素，口前該技術(shù)沒有廣泛應(yīng)用。針對市場上食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行大批量的檢測，是一件很

6、不容易的事 情。目前市場上還沒有真正好的產(chǎn)品能夠?qū)瘘S色葡萄球菌進(jìn)行快速檢測。首 先要求檢測速度快，目前的方法大部分需要培養(yǎng)，至少2448小時，不利于現(xiàn) 場檢測，48小時以上商家才能拿到檢測結(jié)果，才能進(jìn)行市場銷售，熟食就沒有 了新鮮度可言，所以檢測速度成了菌類包括金黃色葡萄球菌檢測的關(guān)鍵影響因 素。其次是目前中國食品安全的重視度不夠，一般市場沒有相應(yīng)的檢測實(shí)驗(yàn)室 和檢測設(shè)備。上述需要儀器設(shè)備的檢測方法完全行不通。熟食和冷藏食品中金 黃色葡萄球菌數(shù)量很少，在10個以內(nèi)，為快速檢測增加了難度。而且人員素質(zhì) 低，專業(yè)人員比例少是客觀存在的現(xiàn)實(shí)，不可能進(jìn)行如分子生物學(xué)檢測之類的 實(shí)驗(yàn)，檢測成本問題也不

7、可忽視，白姓不希望在買菜的同時附加上一大筆檢測 薩用。而決關(guān)鍵性問題可以提高檢測速度，通過不斷的研究和總結(jié)金黃色葡萄球菌快 速增殖的環(huán)境和條件，在增菌液中進(jìn)行擴(kuò)增，使菌數(shù)達(dá)到膠體金的檢測下限， 用膠體金方法檢測，此方法檢測時間為410個小時（其中金黃色葡萄球菌擴(kuò)增 時間為410小時，檢測時間為3分鐘），操作簡單，不川任何實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè) 備，檢測試劑盒價格低廉，比較適合金黃色葡萄球菌檢測初篩。檢測膠體金試劑卡分兩種，一種是檢測金前菌腸毒素ABC,另一種選取特異性 菌壁蛋白，用基因工程方法合成抗原，對鼠進(jìn)行免疫制出兩株單克隆抗體，用 雙抗夾心法制成膠體金檢測卡，對于金黃色葡萄球菌屬檢測率為96隊(duì)特異

8、性實(shí) 驗(yàn)證明與副溶血弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌小川型、0139型 及569B型等菌無交叉反應(yīng)；假陽性率在5%以下、假陰性率在遙以下；同一批次 的試紙條10次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致。檢測方法：將待檢測食品取10g食物樣品在10%aCl溶液中涮洗5次，加入增菌 液增菌（配合37c手持小儀器使川可縮短增菌時間），加入菌裂解液搖勻，取3 滴點(diǎn)板。結(jié)果判斷如下圖示：陰性陽性無效金黃色葡萄球菌仍然是食品安全的隱患，檢測依然重要。人們吃上放心的食品 是食品安全工作者的責(zé)任。希望今后能夠繼續(xù)開發(fā)出更好的金葡菌快速檢測方 法和檢測試劑盒4直接平板計數(shù)法（FDABAM&ISO）1 .檢樣（50g+450m

9、L稀釋液）2 .適當(dāng)十倍稀釋樣品3 .選擇2、3個連續(xù)適宜稀釋度4 .吸取1ID1菌液按照、分別涂布于3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗(yàn)）35, 4548h5 .確證試驗(yàn)報告FDABAM金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)一法檢樣（50g+450mL稀釋液）6 .適當(dāng)十倍稀釋樣品7 .選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管10%NaClTSB肉湯，每管接種1mL35, 482h8 .從生長的管中接種1環(huán)劃線于Baird-Parker平板上35, 48h9 .確證試驗(yàn)10 .報告FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)1 .凝固酶試驗(yàn)方法：從平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落

10、，移種到TSB/BHI肉湯 中，置35c培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物同凝固酶試驗(yàn)兔血漿充分混合，置 35c培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。試驗(yàn)中需同時做已知陽性 和陰性對照。結(jié)果判定：以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動為陽性。部分凝固 （2+和3+）的必須進(jìn)行生化鑒定加以證實(shí)。FDABAM金黃色葡萄球菌確證試驗(yàn)2 .革蘭氏染色對所有的可疑培養(yǎng)物都要進(jìn)行革蘭氏染色。3 .生化鑒定過氧化氫酶試驗(yàn)前萄糖厭氧利用試驗(yàn)甘露醇厭氧利用試驗(yàn)金葡溶菌酶敏感性試驗(yàn)?zāi)蜔岷怂崦冈囼?yàn)（輔助）ISO金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)一MP法1 .檢樣（xg+9xmL稀釋液）2 .適當(dāng)十倍稀釋樣品3 .選擇3個適宜

11、的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個稀釋度接種三管modifiedGiolittiandCantonibroth,37, 24、48h4 .從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中接種1環(huán)培養(yǎng)物于Baird-Parker平板上37, 48h5 .確證試驗(yàn)6 .報告簡介金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含90%的和10%的。其肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比革蘭氏陰性菌致 密，染色時結(jié)晶紫附著后不被酒精脫色故而呈現(xiàn)紫色，相反，陰性菌沒有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)， 所以紫色被酒精沖掉然后附著了沙黃的紅色。金黃色葡萄球菌與的發(fā)現(xiàn)有很大的淵源。 當(dāng)年就是在他的金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿中發(fā)現(xiàn)有些球菌被殺死了，于是發(fā)現(xiàn)了青零 素。而研究也表明青霉素只對以金黃色葡萄球菌

12、為代表的革蘭氏陽性菌作用明顯。這也 是由肽聚糖層的厚度和結(jié)構(gòu)造成的。新出現(xiàn)的耐甲氧西林，被稱作，幾乎能抵抗人類現(xiàn) 在所有的藥物，但是萬古霉素可以對付它。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑im左 右，下排列成葡萄串狀。顯微圖像 金黃色葡萄球菌無芽胞、，大多數(shù)無莢膜，陽性。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普 通上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37，C,最適生長,干燥環(huán)境下可存活數(shù) 周。平板上厚、有光澤、圓形凸起，直徑12mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血 環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在1015%NaCI肉湯中生長?？煞?解、，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解，水解，

13、還原， 液化。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對類藥物敏感性低，但對青霉素、等高度敏 感。對堿性染料敏感，十萬分之一的龍膽紫液即可抑制其生長。麗笏性(resis勿ce)是微生物對抗菌藥物的相對抗性，是微生物進(jìn)化過程的自然界規(guī)律，也是微生物耐藥基因長期進(jìn)化的必然結(jié)果。由于抗菌藥物殺死了敏 感菌群，而對耐藥菌的存活和繁殖無效，所以耐藥性是過度使用和濫用抗菌藥 的必然后果。當(dāng)前，耐藥菌的產(chǎn)生和蔓延已經(jīng)成為世界性問題。如肺炎、結(jié)核 病和瘧疾等，由于其微生物對許多現(xiàn)有藥物產(chǎn)生了耐藥性而變得越來越難以治 療。耐藥性是如何形成和發(fā)展的如何遏制這一威脅已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問 題。1耐藥性的類型瞄藥性吩為:天

14、然耐藥性、獲得耐藥性、多重耐藥性以及交叉耐藥性1。 天然耐藥性,又稱原發(fā)性耐藥性，遺傳性耐藥性，內(nèi)源性耐藥性、它決定抗菌 譜。如全部腸桿菌科細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素、利蔡嚶酮、奎奴普丁和莫 匹羅星；鮑曼不動桿菌對氨芳西林、阿莫西林和第一代頭胞菌素；銅綠假單胞 菌對氨芳西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、第一、二代頭胞菌素、頭胞嚏 胎、頭抱曲松、蔡嚏酸和甲氧喀嚏;肺炎鏈球菌對甲氧嚏嚏和氨基糖苔類；嗜 麥芽窄食單胞菌對亞胺培南；沙雷菌屬對氨芳西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉 維酸、第一代頭胞菌素、頭胞味辛和多黏菌素E均屬天然耐藥。天然耐藥性是 某種細(xì)菌固有的特點(diǎn)，其原因可能是此類細(xì)菌具有天然屏障，

15、藥物無法進(jìn)入細(xì) 菌體內(nèi)或由于細(xì)菌缺少對藥物敏感的靶位所至。法得性痛藥性是在微生物接觸抗菌藥物后.由于遺傳基因的變化、生存代謝途 徑的改變而產(chǎn)生的耐藥性。獲得性耐藥性可分為相對耐藥性（又稱中間耐藥性） 和絕對耐藥性（又稱高度耐藥性），前者是在一定時間內(nèi)MIC逐漸升高，后者即使高 濃度也沒有抗菌活性，如耐慶大霉素的銅綠假單胞菌3 o獲得性耐藥性又 有社會獲得性耐藥性和醫(yī)院獲得性耐藥性之分。常見的醫(yī)院獲得性耐藥菌株為 耐甲氧西林金葡菌（MRSA）和凝固酶陰性葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌（VRE）,多重耐藥菌有克雷伯桿菌屬、腸桿菌屬以及假單胞菌。常見的社會 獲得性耐藥菌株有產(chǎn)P內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌屬、耐阿

16、莫西林的卡他莫拉菌，耐 藥肺炎球菌，多重耐藥結(jié)核桿菌、沙門菌屬、志賀菌屬、彎曲菌屬以及耐青霉 素淋病奈瑟菌屬。醫(yī)院獲得性感染，僅在美國一年就有40, 000病例死亡，幾 乎都是由耐藥菌所致；國內(nèi)對2000 2001年從13家醫(yī)院分離的805株革蘭陽 性菌進(jìn)行耐藥監(jiān)測。結(jié)果.MRSA檢出率為，其中醫(yī)院獲得性耐藥菌株的檢出率 為,社會獲得性耐藥菌株為；乂1為，耐青霉素肺炎球菌（PRSP）為，屎 腸球菌(AREF)對氨羊青霉素耐藥率為。大腸桿菌對各種唆諾酮類呈交叉耐藥, 耐藥率高達(dá)60%o多重耐藥性是指同時對多種抗菌藥物發(fā)生的耐藥性。是外排膜泵基因突變和 外膜滲透性的改變及產(chǎn)生超廣譜酶所致4, 5

17、o最多見的是耐多藥結(jié)核桿菌 和耐甲氧西林金葡菌，以及在ICU中出現(xiàn)的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌,僅對 青霉烯類敏感:嗜麥芽窄食單胞菌幾乎對復(fù)方新諾明以外的全部抗菌藥耐藥。 交叉謝藥性是指藥物間的耐藥性互相傳遞.主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)相似的抗菌藥物之 間。如目前大腸桿菌對瞳諾酮類的交叉耐藥率已超過60%。2夠藥性的產(chǎn)生及蔓遜細(xì)菌耐藥性可通過在某一核昔酸堿基對發(fā)生突變，導(dǎo) 致抗菌藥物作用靶位的改變，或通過細(xì)菌DNA的全部重排，包括倒位、復(fù) 制、插入、中間缺失或細(xì)菌染色體DNA的大段序列的“轉(zhuǎn)座子”或插入順序來完 成，也可由質(zhì)?；蚱渌z傳片段所攜帶的外來DNA片段，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥 性4。質(zhì)粒是一種染色體外

18、的DNA,耐藥質(zhì)粒廣泛存在于革蘭陽性和陰性 細(xì)菌中，幾乎所有致病菌都有耐藥質(zhì)粒。因此通過耐藥質(zhì)粒傳遞的耐藥現(xiàn)象最 為主要，也最常見。耐藥質(zhì)粒有兩種主要類型，即接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì) 粒。接合型質(zhì)粒的耐藥因子包括具有一個至數(shù)個耐藥基因，通過改變細(xì)菌細(xì)胞 壁或細(xì)胞膜的通透性，或阻斷抗菌藥到達(dá)作用靶位等作用，使細(xì)菌對抗菌藥產(chǎn) 生耐藥的決定因子，以及負(fù)責(zé)耐藥因子轉(zhuǎn)移時所需物質(zhì)的制備和合成的耐藥轉(zhuǎn) 移因子。非接合型質(zhì)粒的耐藥因子僅有耐藥決定因子而無耐藥轉(zhuǎn)移因子，故不 能通過細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移?？咕幱卸喾N類型，但細(xì)菌在抵抗各個藥物的作用時， 可通過一種或多種途徑對一種或多種不同類型的抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。主要有：

19、(1)產(chǎn)生藥物失活酶或鈍化酶。如P內(nèi)酰胺酶(P-Iactamase)使。內(nèi)酰胺類 抗菌藥的酰胺鍵斷裂而失去抗菌活性4, 6 o目前最重要的p內(nèi)酰胺酶是超 廣譜。內(nèi)酰胺酶(ESBLs)、染色體異型酶(AmpC)和OXA。ESBLs主要由質(zhì)粒介 導(dǎo),大約有160余種，分為TEM、SHV、OXA等類型。TEM型由廣譜酶TEM-1 和TEM-2的基因發(fā)生突變，造成14個氨基酸改變形成的一系列酶蛋白，目 前大約有70余種。SHV型有30余種，由廣譜酶SHV-1的基因發(fā)生突變，造成 14個氨基酸改變而形成。OXA型有13種，主要的水解底物是苯嗖西林，故 又命名為OXA,是來源于OXA-1、OXA-2和OX

20、A-10三種基因發(fā)生突變所 至。ESBLs主要在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，在腸桿菌屬、變形桿菌 屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科及銅綠假單胞菌中也多有發(fā)現(xiàn)。ESBLs導(dǎo)致細(xì)菌 對第三代頭胞菌素、氨曲南及第四代頭胞菌素耐藥。AmpC既可由染色體介導(dǎo), 也可由質(zhì)粒介導(dǎo).因?qū)︻^胞菌素水解率高于青霉素類,故又稱為頭胞菌素酶，迄今 已達(dá)30余種，已報道7-9的質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC型酶有MIR-1、ACT-1、 CMY-2. LAT-1、LAT-2等;OXA是ESBLs酶的一種，又稱金屬。內(nèi)酰胺酶或 碳青霉烯水解酶，能滅活青霉素、頭胞菌素和碳青霉烯類抗菌藥.甚至能滅活酶 抑制劑，包括克拉維酸、舒巴坦和他嘎巴坦

21、等。氨基音類鈍化酶是細(xì)菌對氨基昔 類產(chǎn)生耐藥性的最常見也是重要的機(jī)制。許多革蘭陰性桿菌、金葡菌和腸球菌 屬等均可產(chǎn)生鈍化酶，對氨基音類分子結(jié)構(gòu)中的氨基糖分子的活性基因進(jìn)行修 飾而使之失去抗菌作用。目前已知有乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)和核 若轉(zhuǎn)移酶(AAD或ANT)3類鈍化酶。不同的氨基若類可為同一種酶所鈍化，而 同一抗菌藥又可為多種鈍化酶所鈍化。這是因?yàn)橐环N抗菌藥的分子結(jié)構(gòu)中可能 存在多個結(jié)合點(diǎn)所致。例如妥布霉素可為6種酶所鈍化，慶大霉素可為5種酶 所鈍化，而阿米卡星則主要為一種AAC所鈍化。(2)靶部位發(fā)生改變。細(xì)菌可改變抗菌藥與核糖體的結(jié)合部位而導(dǎo)致大環(huán) 內(nèi)酯類、林可霉素類

22、和氨基昔類等藥物不能與其作用靶位結(jié)合，也可阻斷抗菌 藥抑制細(xì)菌合成蛋白質(zhì)的能力。細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥主要是因?yàn)楹颂求w 50S的腺喋吟殘基轉(zhuǎn)錄后甲基化，使藥物不能與核糖體結(jié)合而抑制了蛋白質(zhì)的 合成。細(xì)菌核糖體30S亞單位的S12蛋白可發(fā)生突變，使鏈霉素不能與核糖體 結(jié)合而導(dǎo)致耐藥。革蘭陽性菌可由于其青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變，使其與。 內(nèi)酰胺類抗菌藥的親和力降低，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。例如肺炎鏈球菌可以從耐青霉 素鏈球菌屬中獲得耐藥基因片段與自身基因組合成鑲嵌式耐藥基因，使之成為 耐青霉素肺炎鏈球菌。金葡菌與屎腸球菌中的一些菌株可誘導(dǎo)產(chǎn)生新的PBPs, 與。內(nèi)酰胺類的親和力明顯降低，造成細(xì)菌耐藥

23、。在淋病奈瑟球菌和流感嗜血 桿菌等革蘭陰性菌的某些菌株中也存在與P內(nèi)酰胺類親和力降低的PBPs而導(dǎo)致 細(xì)菌耐藥。(3)膜泵外排。細(xì)菌普遍存在著主動外排系統(tǒng)，它們能將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的多種 抗菌藥物主動泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。目前已知有5個家族、20多種外排 泵。主動外排系統(tǒng)首先是在大腸埃希菌對四環(huán)素的耐藥機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)的。細(xì) 菌中的主動外排系統(tǒng)可分為4類：MF類、RND類、Smr類和ABC類。在銅綠 假單胞菌、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷伯菌、包皮垢分支桿菌、金葡菌、大腸埃 希菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌等細(xì)菌以及白念珠菌中均存在主動外排系統(tǒng)。 氯霉素、紅霉素、氟瞳諾酮類和p內(nèi)酰胺類等抗菌藥物均可由一種或

24、數(shù)種主動 外排系統(tǒng)泵出細(xì)胞外。(4)其他。物建立靶旁路系統(tǒng)，使金葡菌產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白PBP2a,取代 了固有的青霉素結(jié)合蛋白PBPs,與0內(nèi)酰胺類抗生素的親和力減低，致甲氧西 林對金葡菌耐藥；改變代謝途徑，使抗菌藥物與細(xì)菌生長所必須物質(zhì)如葉酸結(jié)合， 影響其生長繁殖:降低細(xì)胞膜(或壁)的通透性，導(dǎo)致細(xì)菌膜蛋白變性、膜孔蛋白 缺損或形成生物膜，使亞胺培南對銅綠假單胞菌耐藥等9。通常情況下，由 染色體介導(dǎo)的耐藥性，耐藥基因是由染色體編碼介導(dǎo)，即DNA或RNA突變所 致，耐藥菌往往有一定缺陷，其特點(diǎn)是發(fā)生率較低(1/105)。但質(zhì)粒(又稱R-質(zhì)粒) 介導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥菌則與敏感菌一樣，特點(diǎn)是通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)

25、導(dǎo)、結(jié)合及易位等方 式,其發(fā)生率高，通常表現(xiàn)在產(chǎn)生失活酶或修飾酶而耐藥?？裳杆偕L繁殖，并 可在正常人和體弱者中引起感染。無論質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的耐藥性，一般只發(fā) 生于少數(shù)細(xì)菌中，難于與占壓倒優(yōu)勢的敏感菌競爭，故其危害性不大。只有當(dāng) 敏感菌因抗菌藥物的選擇性作用而被大量殺滅后，耐藥菌才得以大量繁殖而成 為優(yōu)勢菌，并導(dǎo)致各種感染的發(fā)生。因此，細(xì)菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展是抗菌藥 物廣泛應(yīng)用，特別是無指征的過度使用和濫用的后果。耐藥基因和耐藥菌株在 人與人或人與畜之間均能夠傳播與蔓延。當(dāng)一個病人感染耐藥菌株，就可以成 為重要的傳播源。在醫(yī)院，一個感染了 MRSA的病人，往往成為其他許多人感 染或帶菌的來源

26、。因此，在采取行動遏制耐藥性時，除了應(yīng)該考慮耐藥性的出 現(xiàn)，也必須考慮耐藥菌株的傳播。單一微生物細(xì)胞能夠攜帶耐藥基因?qū)Ω墩麄€ 系列的、完全不相關(guān)的抗菌藥物。例如引起痢疾的志賀菌，它的基因鏈的每一 個耐藥性編碼都能對抗一種不同的抗菌藥，所以它對任何一種抗菌藥可產(chǎn)生耐 藥性。而且這一基因鏈能夠從一個細(xì)菌細(xì)胞傳遞到另一個細(xì)胞。因此，一種以 往敏感的志賀菌，在一次攻擊過程中，就可以獲取5個或6個耐藥基因。一個細(xì)菌在24h內(nèi)可將耐藥基因留下1,677,722個后代，還橫向傳給其他細(xì)菌3,9 o抗菌藥物本身并不產(chǎn)生耐藥性，只是在抗菌藥物被不合理使用時才加劇這 過程。當(dāng)抗菌藥物自然選擇有利于產(chǎn)生耐藥性基因的

27、細(xì)菌生存時，耐藥性便 產(chǎn)生了。所有抗菌藥物的使用，無論適宜與否，都對細(xì)菌群有一種選擇性的壓 力，而且抗菌藥物使用越多，壓力越大。所以，不適當(dāng)?shù)厥褂?，包括藥品的錯 誤選擇、劑量不正確或不良的治療順應(yīng)性等都能造成耐藥菌的產(chǎn)生。如肺炎， 及時用青霉素治療，肺炎鏈球菌就會被殺死，感染在耐藥性出現(xiàn)之前得到治 愈。然而，若藥物劑量或給藥間隔時間不準(zhǔn)確，青霉素對肺炎鏈球菌的耐受突 變株就有時間產(chǎn)生、繁殖、并替代對青霉素易感的菌群，不僅治療結(jié)果不好， 而且使急性感染中的肺炎鏈球菌也就成了許多第一線藥品的耐藥菌。另據(jù)國家 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測中心2002年的報告（60余家醫(yī)院）12, 13 o MRSA的平均耐 藥率

28、，1988年為, 1999年為, 2000年為。MRSA對慶大霉素的耐藥率 為,氯霉素為44%,環(huán)丙沙星為，紅霉素為.復(fù)方新諾明為67%,四環(huán)素為 61%。我國結(jié)核病人耐藥率已達(dá)到 %,其中一部分病人對目前常用的抗結(jié)核 藥物已無效，成為長期細(xì)菌的感染源和結(jié)核控制中的一大難題。3耐藥性的預(yù) 防和遏制抗菌藥耐藥性是一種自然的生物學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)菌等微生物受到抗菌物 藥使用的選擇性壓力的反應(yīng)。最主要的辦法是預(yù)防感染，其后才是遏制問題。 自從抗菌藥使用以來，它就促使了耐藥性的產(chǎn)生，因此，任何遏制戰(zhàn)略都應(yīng)該 歸結(jié)于盡量減少抗菌藥物不必要、不適當(dāng)或者不合理的使用。對于藥耐藥性的 產(chǎn)生，醫(yī)院是一重要環(huán)節(jié)，因?yàn)楦?/p>

29、度易感染病人常常需要延長抗菌藥治療，并 出現(xiàn)交叉感染的問題。每家醫(yī)院都應(yīng)該遏制和控制多重耐藥菌的高發(fā)比例，有 效的控制醫(yī)院感染，具體的做法是：（1）建立良好的微生物實(shí)驗(yàn)室，并發(fā)揮其診斷服務(wù)的重要作用。（2）加強(qiáng)抗菌藥物處方的管理，限制抗菌藥臨床適應(yīng)證范圍。（3）預(yù)防多重耐藥菌在院內(nèi)的傳播，加強(qiáng)院內(nèi)感染的控制。（4）提高 患者正確使用抗菌藥的認(rèn)識，即抗菌藥不能隨便用。用抗菌藥來對付感冒，基 本上是沒有用的。（5）抗菌藥使用的原則是能用窄譜的就不用廣譜的，能用低 級的就不用高級的，用一種能解決問題的就不要幾種聯(lián)合用。（6）一般情況下，不要為 了預(yù)防而使用抗菌藥，特別是廣譜抗菌藥。還要避免外用青霉素

30、類、頭胞菌素類及氨基糖 音類抗生素，不要把這些抗菌藥配成液體沖洗傷口，避免誘發(fā)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生。（7）嚴(yán)格 控制抗生素的預(yù)防使用和非醫(yī)療中農(nóng)、林、牧、副、漁以及飼料的抗生素使用。（8）采取 限用策略，如輪作制，即將某些抗菌藥停用一段時期后再用，以恢復(fù)細(xì)菌對藥物的敏感 性。（9）根據(jù)藥效學(xué)/藥動學(xué)（PK/PD）特征制訂方案等14-16 o抗菌藥分為濃度依 賴型和時間依賴型二種類型，所以在根據(jù)PK/PD參數(shù)制訂給藥方案時，也有較大的不同。 濃度依賴型抗菌藥，濃度越高殺菌力越強(qiáng)，如喳諾酮類、氨基糖甘類、兩性霉素B和甲硝 嗖等。其藥效學(xué)參數(shù)是：24h藥物濃度時間曲線下面積（AUC） /MIC,即AUIC

31、125250 時不但起效快.且能有效地殺滅細(xì)菌和抑制耐藥菌株產(chǎn)生，臨床有效率可達(dá)90%,故應(yīng)該大 劑量每日1次給藥。以及血清藥物峰濃度（Cmax） /MIC的比值8 12。如氨基糖昔類為 每日1次.哇諾酮類為每日12次為宜。研究表明，如果哇諾酮類的AUIC100時，細(xì)菌 即使未被清除，其對藥物的敏感率仍維持在90%以上；倘若AUICclOO,則耐藥菌會逐日 增加，最終細(xì)菌幾乎全部耐藥。時間依賴型抗菌藥，包括青霉素類、頭狗類和大環(huán)內(nèi)酯類 的多數(shù)品種。其Cmax相對不重要，而藥物濃度維持在MIC以上的時間對預(yù)測殺菌力更為 重要8, 15。時間依賴型抗菌藥要求血清藥物濃度大于最低抑菌濃度（TMIC）,其 持續(xù)時間應(yīng)超過給藥間期的40% 50%。不同菌種要求給藥間隔時間的百分比不同。頭地 菌素類的最佳療效為TMIC60%70%,青霉素為50%。所以，時間依賴型抗菌藥需要每日 多次給藥，或持續(xù)滴注，以維持MIC在