牛奶中酪蛋白含量的測定

1、牛奶中酪蛋白的提取及含量測定一、實驗原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（ 5%） 、脂類（ 4%） 、蛋白質(zhì)（3.5%） 、維生素、微量元素（Ca、 P 等礦物質(zhì)） 、水（ 87%）牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一種二糖，它由 D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通過B-1,4瓢昔鍵連接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，當乙醇混入乳糖水溶液中時，乳糖會結晶出來，從而達到分離的目的。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和乳清蛋白兩種， 其中酪蛋白占了牛乳蛋白質(zhì)的 80%。酪蛋白是白色、無味的物質(zhì)，不溶于水、乙醇等有機溶劑，但溶于堿溶液。而乳清蛋白水合能力強，分散性強，在牛乳中呈高分子狀態(tài)。2、等電點沉淀法：在等電點時

2、，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零（即正負電荷相等），此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱， 其顆粒極易碰撞、 凝聚而產(chǎn)生沉淀， 所以蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等電點為 4.7左右（不同結構的酪蛋白等電點有所不同） ， 本實驗中將牛乳的 pH 調(diào)值 4.7 時， 酪蛋白就沉淀出來。市售牛奶通常會添加耐酸堿穩(wěn)定劑來增加粘稠度， 以致即使 pH 調(diào)至等電點酪蛋白也沉淀的很少，故實驗時可將pH 稍微調(diào)過多一點再調(diào)回等電點。同時，市售牛奶由于生產(chǎn)過程通常導致酪蛋白組分發(fā)生變化，因而使pI 偏離了4.7，通常偏酸。3、酪

3、蛋白的提純根據(jù)乳糖、 乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性質(zhì)差異， 可以用純水洗滌來除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的雜質(zhì)，再用乙醇除去脂類，然后過渡到用乙醚洗滌，由于乙醚很快揮發(fā)，最終得到純粹的酪蛋白結晶。4、蛋白質(zhì)含量的測定（考馬斯亮藍結合法）考馬斯亮藍能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結合， 這種結合具有高敏感性。 考馬斯亮藍G520的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在 465nm。當它與蛋白質(zhì)結合形成復 合物時呈藍色，其最大吸收峰變?yōu)?95nm。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍 G520-蛋白質(zhì)復合物呈色后，在595nm 下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關系，故可以測定蛋白質(zhì)濃度。二、實驗器材與試劑1、器材：恒溫水浴鍋、離心機、抽

4、濾裝置、蒸發(fā)皿、精密 pH 試紙、旋渦混合器、紫外分光光度計、試管*9、 5mL 吸管、 50mL 容量瓶、 100mL 量筒、電子分析天平2、試劑：鮮牛奶、pH4.7 醋酸 -醋酸鈉緩沖溶液、乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、無水乙醴體積比1: 1）、0.9%NaCl溶液、標準蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、 考馬斯亮藍G520染液三、實驗操作記錄1、酪蛋白的制備將20mL牛奶盛于100mL的燒杯中加熱到40C ,在攪拌下慢慢加入預熱至 40C、pH4.7的醋酸緩沖溶液20mL。用冰醋酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.7,此時即有大 量的酪蛋白沉淀析出。將上述懸浮液冷卻至室溫，離心5min（ 4000r

5、/min ） ，棄去上清液，沉淀即為酪蛋白粗品。用蒸餾水洗滌沉淀3 次（每次約20mL） ，離心5min（3000r/min ） ，棄去上清液。在沉淀中加入約 20mL95%乙醇，攪拌片刻，將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移到布氏漏斗中抽濾，用乙醇-乙醴混合溶液洗滌沉淀2次，最后用乙醴洗滌沉淀2次，抽 干。將沉淀攤開在培養(yǎng)皿中，風干，保存至下周。2、標準曲線的制作取7支干凈干燥試管，按下表進行編號并加入試劑?；靹颍覝仂o置3min,以第一管為空白，于波長 595nm處比色，讀取吸光度，以吸光度為縱坐標，各標準液濃度為橫坐標得標準曲線。表1標準曲線的制作試劑編號1 （空白）234567標準蛋白液/mL0.10.

6、20.30.40.60.80.9%NaCl/mL1.00.90.80.70.60.40.2考馬斯亮藍染液/mL4.04.04.04.04.04.04.0蛋白質(zhì)濃度/（ a g/mL）0102030406080也州ran0.0000.1510.2600.3260.4400.5350.6363、樣液的測定準確稱取25mg自制酪蛋白，置于50mL燒杯中，加入約20mL0.9%NaCl,再準確加入1mol/L NaOH 5mL ,當酪蛋白溶解后，準確加入1mol/L乙酸5mL,充分振搖直至酪蛋白完全溶解為止（不溶可在50c水浴加熱至溶），全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，力口 0.9%NaCl稀釋定容至50

7、mL,充分搖勻。取5mL上述蛋白液, 轉(zhuǎn)移至另一個50mL容量瓶中，用0.9%NaCl稀釋定容至50mL。另取一支干凈試管，加入樣品液1.0mL及考馬斯亮藍染液4.0mL,混勻，室 溫靜置3min,于波長595nm處比色，讀取吸光度，由樣品液的吸光度查標準曲 線即可求出含量。四、實驗結果1、酪蛋白產(chǎn)量及產(chǎn)率計算表2酪蛋白產(chǎn)量及產(chǎn)率計算酪蛋白質(zhì)量/g牛奶樣品質(zhì)量/g產(chǎn)率/g0.7820.033.89%2、標準曲線標準曲線由散點圖可以看出，后兩個點與前面幾個點的線性關系并不好，出現(xiàn)了明顯的負偏差。故在線性擬合時舍去后兩個點，取前 5個點進行擬合。擬合出的直線R2達到0.983,線性較好。2、樣品液

8、的吸光度是0.324對照標準曲線得酪蛋白濃度為 28.40卜g/mL。稱取的酪蛋白樣品質(zhì)量為0.0267g稀釋彳音數(shù)為500倍,翻蛋門濃度 X LOmLx 5削）28.40xlO_6xlxSOO3（酪蛋白）=泊LX =。% =W67* 1 00% =53.2%五、誤差分析與討論1、本次制備實驗中得到的蛋白質(zhì)量較多，但純度較低，分析原因如下：1）得到的蛋白質(zhì)略呈黃色，且有些發(fā)粘，說明可能脫脂不徹底，蛋白質(zhì)產(chǎn)品中 含有脂質(zhì)。2）考馬斯亮藍G520染液中有沉淀，最后影響考馬斯亮藍-蛋白質(zhì)復合物溶液的 吸光度。3）配制標準溶液時操作上可能有誤差，如往試管中加入溶液時掛在管壁，且最終也沒有與下方溶液混合均勻，導致標準溶液的濃度可能不準，致使標準曲線不準，數(shù)據(jù)處理時也發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)線性并不好， 尤其是濃度較大時，雖然可能是超出考 馬斯藍線性范圍，但不能排除操作失誤的可能。2、注意事項1）試管提前一周清洗干凈并晾干，否則制作標準曲線時無法保證各管濃度。并 且不干凈的試管在加溶液時容易掛管壁，不利于控制標準蛋白