關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后軟骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后軟骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究                  作者：宋長志，楊淮海，董啟榕【摘要】  目的 探討關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后軟骨細(xì)胞的凋亡特點(diǎn)。方法 利用鉆頭鉆孔造成兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶苷酸缺口末端標(biāo)記法、透射電鏡、流式細(xì)胞儀等方法對受損軟骨進(jìn)行檢測。結(jié)果 損傷后軟骨細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡，損傷后第4天軟骨細(xì)胞凋亡率最大，凋亡細(xì)胞全層分布，主要分布在淺表層

2、和中間層。結(jié)論 關(guān)節(jié)軟骨損傷后軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，4 d達(dá)高峰，以后逐漸減少。提示關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后，早期抑制軟骨細(xì)胞的凋亡對防治骨關(guān)節(jié)炎可能有十分積極的意義。 【關(guān)鍵詞】  軟骨；急性損傷；凋亡Experimental Study on Chondrocyte Apoptosis Following Acute Osteochondral Injury    Abstract：Objective  To explore the characteristics of chondrocyte apoptosis following acute os

3、teochondral injury.Methods  Drill holes were created in rabbit knees.TUNEL，transmission election microscopy(TEM)，fluorescence?activated cell sorter(FACS) were applied to study the injured femoral condyles obtained at different intervals following drill injury.Results  On post?injury day 4，

4、the injured cartilage specimens displayed  statistically significant increased overall level of apoptosis，most of apoptotic chondrocytes were confined to the superficial tangential zone and the middle zone.Conclusion  Chondrocyte apoptosis may contribute to the subsequent development of po

5、st?traumatic arthritis.It would be important to prevent the knee from post?traumatic arthritis by repressing chondrocyte apoptosis as early as possible.    Key words：cartilage；acute lnjury；apoptosis    細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，特點(diǎn)是胞體縮小、DNA片斷、出現(xiàn)凋亡小體以及炎癥反應(yīng)。

6、細(xì)胞凋亡發(fā)生在對機(jī)械和熱損傷、毒素、細(xì)胞因子、病毒和細(xì)菌等因素的應(yīng)答中1。Kim等2的研究表明，軟骨細(xì)胞的凋亡可能會導(dǎo)致創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。軟骨損傷后的病理改變及其引起創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機(jī)制還不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過對兔膝關(guān)節(jié)急性損傷模型的觀察，探討軟骨急性損傷后細(xì)胞死亡的方式以及與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生之間的關(guān)系。1  材料與方法1.1  動物模型的制作 選用新西蘭大白兔，重2.53.0 kg。2戊巴比妥鈉靜脈麻醉，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)局部剪毛。參照Costouros等3介紹的方法，用2.0 mm直徑的鉆頭鉆孔造模。兔取仰臥位，四肢固定，膝關(guān)節(jié)屈曲。常規(guī)碘伏消毒，髕韌帶內(nèi)側(cè)切口，過屈膝

7、關(guān)節(jié)顯露股骨內(nèi)外髁承重面，用直徑2.0 mm的鉆頭在股骨內(nèi)外髁承重面鉆孔，鉆透全部軟骨直至軟骨下骨，深度23 mm，造成膝關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械性損傷。鉆孔后，沖洗關(guān)節(jié)腔后逐層縫合，蘇醒后分籠飼養(yǎng)，自由活動。1.2  動物分組 選用新西蘭大白兔28只，體重2.53.0 kg。隨機(jī)選擇一側(cè)膝關(guān)節(jié)造模，對側(cè)作為對照。選擇術(shù)后第0、2、4、7、10、14天和4周為觀察時(shí)間點(diǎn)，并據(jù)此隨機(jī)分為7組，即0 d(4只)、2 d(4只)、4 d(4只)、7 d(4只)、10 d(4只)、14 d(4只)、4周(4只)。另外再取新西蘭大白兔20只，16只雙側(cè)膝關(guān)節(jié)鉆孔造模致軟骨損傷，作為損傷組，4只作

8、為正常組(兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞本身數(shù)目較少，一個(gè)損傷部位分離的細(xì)胞數(shù)不能滿足流式細(xì)胞儀檢測的要求。因此實(shí)驗(yàn)中雙側(cè)同樣標(biāo)準(zhǔn)造模，將每只兔兩側(cè)股骨內(nèi)外髁受損區(qū)分離的軟骨細(xì)胞合在一起進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測)，用于流式細(xì)胞儀檢測。1.3  標(biāo)本的采取 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)空氣栓塞處死動物快速采取標(biāo)本。切取股骨內(nèi)外髁鉆孔區(qū)周圍直徑為34 mm全層軟骨。各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋切片，用于脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotide transferase?mediated deoxyuridine?biotin nick end l

9、abeling，TUNEL)觀察。第4天的標(biāo)本同時(shí)切取小部分用于電鏡觀察。用于流式細(xì)胞儀檢測的兔于術(shù)后第2、4、14天和4周空氣栓塞處死(每點(diǎn)4只兔)，無菌操作下切取受損的軟骨，寬約23 mm，置于離心管中，磷酸鹽緩沖液沖洗，2 000 /min離心10 min去除上清液，0.25的胰蛋白酶消化30 min，2 000 /min離心10 min去除上清液，0.2型膠原酶，在37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化，每隔1 h吹打1次，46 h軟骨碎片完全溶解，再經(jīng)過濾、漂洗、計(jì)數(shù)制成細(xì)胞懸液( 大于 1×106/mL )，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測。1.4  透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

10、0;取術(shù)后第4天的受損軟骨及對照側(cè)正常軟骨標(biāo)本各2份。放入2的戊二醛磷酸緩沖液中，置4冰箱48 h作前固定，將標(biāo)本修整成寬約為1.0 mm的長條形，磷酸鹽緩沖液漂洗后，再在1的鋨酸中后固定2 h。按常規(guī)漂洗、脫水、滲透，環(huán)氧樹脂包埋，ULTRACUTE超薄切片機(jī)(德國REICHERT?JUNG)超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，JEM?1200透射電鏡(日本)觀察、攝片(加速電壓60kV)。1.5  流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞凋亡率 將分離的軟骨細(xì)胞PBS洗滌、過濾、計(jì)數(shù)成大于1×106/mL細(xì)胞懸液，加入PI染液，避光作用20 min，上機(jī)檢測。FAcsc alib

11、ur流式細(xì)胞儀(美國BECTON DICKINSON)，cellquest獲取軟件采集數(shù)據(jù)，ModFit2.0DNA擬合軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，得出結(jié)果。1.6  TUNEL檢測軟骨細(xì)胞凋亡率 取術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本，在10的中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間大于48 h。遞增濃度乙醇脫水，石蠟包埋。連續(xù)切片，切片厚度為5 m。標(biāo)本分別行HE染色和TUNEL末端標(biāo)記，利用HE染色光鏡下證實(shí)切片部位包含軟骨損傷部位。TUNEL具體操作步驟詳見Boehringer?Mannheim試劑盒操作說明，以TBS代替一抗作陰性對照，凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色，采用雙盲法，連續(xù)觀察10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)每

12、100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為該標(biāo)本的細(xì)胞凋亡率。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料用±s表示，實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)。百事通 2  結(jié)  果2.1  透射電鏡觀察 正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為圓形或橢圓形，位于軟骨陷窩內(nèi)，細(xì)胞表面有突起和皺褶，細(xì)胞膜下及胞質(zhì)中有較多無界膜的空泡，核呈偏心位，核膜明顯(見圖1)。凋亡的軟骨細(xì)胞突起消失，細(xì)胞從周圍的基質(zhì)中退縮，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、核膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體形態(tài)無改變(見圖2)。2.2  流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測 正常兔關(guān)節(jié)軟骨和造模后各時(shí)

13、間點(diǎn)受損區(qū)關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)型膠原酶消化后，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度1×106/mL)，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(±s)。結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)軟骨損傷后軟骨細(xì)胞凋亡率增高，第4天凋亡率最高，以后呈下降趨勢(見表1)。表1  用流式細(xì)胞儀檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率（略）2.3  TUNEL結(jié)果 關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后立即在緊靠鉆孔區(qū)周圍的軟骨淺表層內(nèi)出現(xiàn)很少數(shù)量的軟骨細(xì)胞凋亡；傷后2 d凋亡的軟骨細(xì)胞延伸到中間層，但主要局限在創(chuàng)傷孔周圍1 mm的軟骨區(qū)域內(nèi)；傷后4 d凋亡率最高，凋亡的軟骨細(xì)胞分布更加廣泛，呈全層分布，距創(chuàng)傷孔延伸的更遠(yuǎn)；傷后14 d軟骨細(xì)胞凋亡明顯減少，仍主

14、要分布在表淺層和移行層，深層較少；傷后4周在淺表層仍見到少量的軟骨細(xì)胞凋亡(見圖37，表2)。表2  TUNEL檢測關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率  (略)3  討 論    現(xiàn)已知道，軟骨細(xì)胞凋亡(即程序性細(xì)胞死亡)，與軟骨圖3  正常的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原位(TUNEL，×100)損傷關(guān)系密切，并且可能與最終的創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)。Honkonen4觀察到脛骨平臺骨折患者于骨折后平均7.6年有44的患者發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。Messner報(bào)道5，利用關(guān)節(jié)鏡觀察單純膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者，14年后有47的患者發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。 

15、;   研究表明，在正常的肥大軟骨細(xì)胞層中約有510的散在的凋亡軟骨細(xì)胞存在6。我們在本實(shí)驗(yàn)中觀察到：正常的兔軟骨細(xì)胞的凋亡率，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果為(3.88±1.49)，TUNEL檢測結(jié)果為(4.78±0.45)；鉆孔造模后軟骨細(xì)胞凋亡在第4天達(dá)最高峰，流式細(xì)胞儀檢測有(60.69±4.78)的軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，TUNEL檢測有(68.21±5.72)的軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，以后逐漸減少。這個(gè)結(jié)果和其他研究者的結(jié)果基本一致。Tew6研究發(fā)現(xiàn)，不論是發(fā)育成熟的還是未成熟的關(guān)節(jié)軟骨，在遭受環(huán)鋸損傷1周后與正常組比較，凋亡的軟骨細(xì)胞數(shù)量增多。

16、Costouros等3也在急性關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨損傷后活體內(nèi)和體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的凋亡比較研究中發(fā)現(xiàn)，不論是在活體內(nèi)還是在體外培養(yǎng)的受損軟骨，在損傷后的第4天凋亡的軟骨細(xì)胞數(shù)最多。DLima7也報(bào)道，在人的關(guān)節(jié)軟骨遭受沖擊負(fù)荷損傷后的第4天，分離軟骨塊的軟骨細(xì)胞凋亡率為32；在兔的膝關(guān)節(jié)活體沖擊負(fù)荷損傷模型中，第4天測得的軟骨細(xì)胞凋亡率為34。Chen等8在其犬的肱骨頭沖擊負(fù)荷損傷實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)沖擊負(fù)荷損傷2 h后，損傷區(qū)軟骨塊體外培養(yǎng)48 h，TUNEL法測得的軟骨細(xì)胞凋亡率高達(dá)74。    另外，我們在實(shí)驗(yàn)中還觀察到：凋亡的軟骨細(xì)胞絕大部分局限在關(guān)節(jié)軟骨的表淺層和中間層

17、，深層較少。Lucchinetti9在他的實(shí)驗(yàn)中，使軟骨重復(fù)負(fù)荷后檢測軟骨細(xì)胞的生存能力，也發(fā)現(xiàn)凋亡的軟骨細(xì)胞主要位于表淺層和中間層，深層較少見。這種現(xiàn)象可能是由于關(guān)節(jié)軟骨各層的軟骨細(xì)胞存在著形態(tài)和表型的差異，導(dǎo)致各層的軟骨細(xì)胞對機(jī)械損傷的敏感程度也不一致。這些特點(diǎn)可能保護(hù)了深層的軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨受到損傷后免于凋亡。    自凋亡細(xì)胞研究以來，檢測方法較多，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。早期有研究者用掃描電鏡，后來被特異性較強(qiáng)的透射電鏡所替代，因其可找到凋亡小體，但透射電鏡卻無法做到定量檢測。而流式細(xì)胞儀室雖可以定量，卻不能反映凋亡細(xì)胞的分布特點(diǎn)。由于凋亡細(xì)胞內(nèi)形成大量含有3羥

18、基末端的DNA雙聯(lián)片斷，因此借助于末端轉(zhuǎn)移酶或DNA多聚酶，可對這些斷段進(jìn)行特異性的標(biāo)記(TUNEL法或TdT法)。這是一種檢測凋亡細(xì)胞的特異性手段，可以使凋亡細(xì)胞在原位被特異性地標(biāo)記和顯示出來，既能進(jìn)行定量檢測，又能反應(yīng)凋亡細(xì)胞在空間上的分布特點(diǎn)。其缺點(diǎn)是不典型凋亡或混雜有大量壞死細(xì)胞時(shí)，可能給標(biāo)記帶來一定的干擾，甚至出現(xiàn)假陽性，因此需結(jié)合其他一般形態(tài)學(xué)檢測方法加以判斷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合幾種方法從不同角度證實(shí)了創(chuàng)傷后凋亡的存在，反映了創(chuàng)傷后軟骨細(xì)胞凋亡的時(shí)間和空間特點(diǎn)。    創(chuàng)傷后軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡的確切機(jī)制尚不清楚，創(chuàng)傷后會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞密度降低、軟骨基質(zhì)降解、關(guān)節(jié)內(nèi)

19、力學(xué)環(huán)境改變、部分細(xì)胞因子的高表達(dá)，這些因素可能會激發(fā)Fas和NO兩種途徑共同作用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。Lotz等在OA患者和OA實(shí)驗(yàn)動物模型中觀察到軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)大量凋亡，在關(guān)節(jié)軟骨表面的細(xì)胞表達(dá)Fas抗原。同時(shí)在含有凋亡細(xì)胞的關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域糖蛋白減少，凋亡細(xì)胞的數(shù)量與NO含量及OA病變程度呈正相關(guān)。    關(guān)節(jié)軟骨損傷后會發(fā)生軟骨細(xì)胞的凋亡，而軟骨細(xì)胞的凋亡與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密不可分，所以搞清楚急性損傷后軟骨細(xì)胞的凋亡特點(diǎn)對骨關(guān)節(jié)炎的防治有著十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示關(guān)節(jié)軟骨急性損傷后的特點(diǎn)是急性損傷軟骨細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，軟骨細(xì)胞凋亡4 d達(dá)高峰，以后逐漸減少，傷

20、后4周仍有凋亡的軟骨細(xì)胞持續(xù)存在?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Nakazawa F，Matsuno H，Yudoh K，et al.Corticosteroid treatment induces chondrocyte apoptosis in an experimental arthritis model and in chondrocyte culturesJ.Clin Esp Rheumatol，2002，20(6)：773?781.2Kim HT，Lo MY，Pillarisetty R.Chondrocyte apoptosis following intra?articular

21、fracture in humansJ.Osteoarthr Cartilage，2002，10(9)：747?749.3Costouros JG，Dang AC，Kim HT.Comparison of chonrocyte apoptosis in vivo and in vitro following acute osteochondral injuryJ.J Orthop Res，2004，22(3)：678?683.4Honkonen SE.Degenerative arthritis after tibial plateau fractureJ.J Orthop Trauma，1995，9(4)：273?277.5Messner K，Maletius W.The long?term prognosis for severe damage to wei