實驗一淀粉酶產(chǎn)生菌的分離和酶活性測定-附件

1、YUNNAN NORMAL UNIVERSITY本科學生實驗報告學號：124120463名:學院： 生命科學學院 專業(yè)、班級： 12 級生物技術(shù)班實驗課程名稱:酶工程實驗一師:吳倩云南師范大學教務(wù)處編印實驗一 淀粉酶產(chǎn)生菌的分離及酶活性測定一、目的要求1、掌握從土壤中分離酶產(chǎn)生菌的方法，學會應用微生物生態(tài)知識分離產(chǎn)酶微生 物。2、掌握淀粉酶活性測定的原理，學會淀粉酶活性的測定方法。二、基本原理一）淀粉酶產(chǎn)生菌的分離1. 菌種的采集 要獲得產(chǎn)生某種酶的菌種，可從富含該酶作用底物的場所去采集。 胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應條件通常和菌的最適生長條件一致，因此要篩 選具有某一特性的酶時，只要到相應的環(huán)境

2、中采樣即可。2. 富集培養(yǎng) 原理：采集到的樣品中如果所需的菌很少，需要先經(jīng)過富集培養(yǎng)，使所需 的菌大量繁殖，而不需要的菌則不生長或少生長，以利于篩選。 富集的方法：控制培養(yǎng)的溫度、pH和營養(yǎng)成分等。3. 菌種的分離 淀粉與碘液反應會形成藍色化合物。 淀粉酶能使淀粉分解為葡萄糖，而葡萄糖與碘反應不會形成藍色化合物， 結(jié)果可使淀粉酶產(chǎn)生菌周圍形成透明圈，從而篩選出淀粉酶產(chǎn)生菌。二）淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵及葡萄糖標準曲線繪制1. 原理：根據(jù)淀粉酶水解淀粉生成還原性糖，還原糖與 3， 5 -二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內(nèi)，還原糖的量和反應液 的顏色呈比例關(guān)系，可利用比色法在

3、540nm 進行測定。2. 酶活定義：在一定P H5.5、37C條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中分解釋放1卩mol葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位U/g。酶活計算公式：酶活（U/g） =A X 5X K X NX 1000/（TX W）A:樣品的OD值（平均值）K:標準曲線的斜率N:稀釋倍數(shù)5:0.2毫升反應液轉(zhuǎn)換為1毫升體積T:反應時間（min）1000:轉(zhuǎn)換因子 1mmol=1000 molW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3 繪制標準曲線 先配制一系列濃度不同的標準溶液，用選定的顯色劑進行顯色，在一定波 長下分別測定它們的吸光度 A。 以 A 為橫坐標，濃度 c 為縱坐標，則得到一條

4、擬合度較好的直線，稱為標 準曲線。 然后使用用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，便可從標準曲 線上找出對應的被測溶液濃度或含量三、器材1試劑：可溶性淀粉、碘、碘化鉀、 HCI、檸檬酸、Na2 HPO 4 12H2O等2培養(yǎng)基：分離、純化培養(yǎng)基3儀器： 平皿、三角瓶、大試管、1mL和10mL移液槍、涂棒； 天平、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、電冰箱、恒溫調(diào)速搖瓶柜、離心機、恒溫 水浴鍋、紫外分光光度計、比色皿、記時器、高壓滅菌鍋。四、操作步驟（一）淀粉酶產(chǎn)生菌的分離1. 培養(yǎng)基的配制及滅菌倒平板配制分離培養(yǎng)基=A高壓滅菌30min '=A冷卻至約50E 倒7塊平板/140mL冷卻備用2.

5、制備土壤稀釋液 稱取土樣1g,放入9mL無菌水試管中，搖動10min,靜置10min,制備得 到10-1 土壤稀釋液； 用無菌吸管吸出1mL土壤懸液，加入盛有9mL無菌水的大試管中，充分 混勻，制備得到10-2 土壤稀釋液； 再從中吸出1mL加入盛有9mL無菌水的大試管中，混勻后得到10-3 土壤 稀釋液； 以此類推，分別制備得到10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀釋液。3. 涂布用無菌吸管分別吸取10-3、10-4、10-5、10-6 和10-7 土壤稀釋液各 0.1mL，對號放入已經(jīng)寫好記號的平板中央，用無菌玻璃涂棒涂勻。37C倒置培養(yǎng)23d（如發(fā)現(xiàn)4. 培養(yǎng)純化 挑取其中透明圈

6、較大的單菌落，劃線于平板， 雜菌需再一次進行純化直到獲得純培養(yǎng)）。5. 產(chǎn)淀粉酶微生物的鑒定向平板內(nèi)加入稀碘液數(shù)滴后進行觀察（二）淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵及葡萄糖標準曲線繪制的配制：蛋白胨：0.7gMgSO4?7H2 :0.02g1. 淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵酵母膏：0.7g CaCI2?2HQ : 0.08g分離培養(yǎng)基（140mL 可溶性淀粉：0.7gKH2 PO4 : 0.07g 瓊脂 ：2.8g將純培養(yǎng)得到的（透明圈 千50r/min搖瓶發(fā)酵約配置發(fā)酵培養(yǎng)基200mL/a（ 40mL/瓶）=A 最大的菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中30 E72h。2. 葡萄糖標準曲線的制作精確稱取0.100g葡萄糖，用緩沖溶

7、液定容至100ml，制得濃度為1mg/ml 的葡萄糖的標準溶液。標準曲線如下圖表所示：0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖標準溶液 體積（ml）葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.01.2緩沖液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容總體積（ml）15151515151515OD( 540nm待測酶液的制備：a.將發(fā)酵液倒入離心管中離心，離心條件 4000轉(zhuǎn)/5分鐘，將離心后的上清 液傾入試管中，稀釋一定倍數(shù)測定其酶活力b.底物溶液一2%£粉溶液（需當天配置）稱取2.0克可溶性淀粉，用約80mL緩沖液調(diào)勻，加熱煮

8、沸直到淀粉完全 溶解；冷卻，并用緩沖液定容至100mL注：如果測定所得ODfi不在有效值（0.2-0.8 ）范圍內(nèi)，則相應地降低或增 大稀釋倍數(shù)后再進行測定。 淀粉酶酶活測定方法操作步 驟空白管樣品管A樣品管B步驟1吸取1.8mL可溶性底物溶液吸取1.8mL可溶性底物 溶液吸取1.8mL可溶性 底物溶液步驟237 C保溫5分鐘37 r保溫5分鐘37 r保溫5分鐘步驟3加入待測酶液0.2毫升加入待測酶液0.2 毫升步驟437 C精確保溫15mi n37 r精確保溫15mi n37r精確保溫15mi n步驟5加入3mLDN試劑終止反應加入3mLDN試劑終止 反應加入3mLDN試劑終止反應步驟6混合

9、均勻混合均勻混合均勻步驟7加入0.2毫升待測酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步驟8流水冷卻流水冷卻流水冷卻步驟9加蒸餾水10mL混勻加蒸餾水10mL混勻加蒸餾水10mL混 勻步驟10OD540nm 匕色OD540nm 匕色OD540nm 匕色五、酶活測定注意事項注:1. 試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；2. 移液槍的使用：向試管內(nèi)加入待測酶液或 DNS時，槍頭不要觸碰管壁，也不 要伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時可以不用更換槍頭！3. 精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，每管之間間隔的時間要合理；4. 避免試管進水：煮沸和用流

10、水沖洗時；5. 實驗結(jié)果的記錄與分析六、實驗報告（一）淀粉酶產(chǎn)生菌的分離結(jié)果、篩選、果 稀釋 倍數(shù)產(chǎn)淀粉酶菌落 數(shù)菌落形態(tài)透明圈大小10-36菌落疏松，呈絨毛狀、絮 狀、蜘蛛網(wǎng)狀，大多為白色， 有的為淡黃色和黑色1.1cm,1.0cm0.9cm,0.8cm0.5cm,3cm10-41絨毛狀，圓形，白色0.8cm10-51絮狀，白色0.9cm10-61絮狀，淡黃色0.5cm10-70（二）葡萄糖標準曲線繪制葡萄糖標準曲線的制作編號123456葡萄糖含量0.20.40.60.81.01.20D( 540nm0.0840.2850.4910.7180.9221.133糖化酶活力測定結(jié)果編號樣品管A樣

11、品管B0D( 540nm0.3320.289糖化酶活力的計算OD的平均值=(A+B /2=(0.332+0.289)/2=0.3105根據(jù)酶活計算公式：酶活(U/g) = (A X K+b) X N x 1000/(T x W)x 5A:樣品的OD值(平均值)K:標準曲線的斜率N :稀釋倍數(shù)5:0.2毫升反應液轉(zhuǎn)換為 1 毫升體積T:反應時間(min)1000:轉(zhuǎn)換因子 1mmol=1000 golW:葡萄糖的分子量(180.2g/mol)代入數(shù)據(jù)可得：酶活( U/g)=( (Ax K+b)x Nx1000/(TxW)x 5 =(0.3105x0.9479+0.126)x1x1000/(15x180.2) x5 = 0.77753、思考題：請你建立一個“篩子”，從土壤中篩選出能產(chǎn)生植酸酶的微生物。答：采集土樣(除土層表面枯枝、雜草和砂石，收集距表層5cm10cmt壤)將采集的土樣進行 10 -1 10 -6 梯度稀釋后，分別涂布于改良的含溴甲酚綠的 植酸鈣平板初篩培養(yǎng)基上，在 30r的恒溫箱中培養(yǎng)3d,