微波與γ射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)

1、蘇州大學(xué)碩士學(xué)位論文微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)姓名：陸敏霞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：衛(wèi)生毒理指導(dǎo)教師：童建20090501微波與，射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)中文摘要中文摘要目的：以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（）和原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為生物模型，研究低強度微波單獨及聯(lián)合丫射線照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)，并初步探討其機理，為輻射防護和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法：將細(xì)胞隨機分為對照組（），、和單獨微波組（分別記為、），單獨射線組（）和微波與射線聯(lián)合暴露組（分別記為、）。原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分組方法參考細(xì)胞，各組分別記為、和。將細(xì)胞放入電磁輻照系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行輻照，連續(xù)照射。第天聯(lián)合組再接受的丫射線照射。丫射線

2、采用輻照，照射劑量，劑量率為。（）采用比色法檢測細(xì)胞的增殖活性。（）利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡情況。（）測定兩種細(xì)胞超微量酶的活性和原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶（）活性。（）采用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞的線粒體膜電位（）和胞內(nèi)游離的變化。結(jié)果：（）單獨微波輻射對細(xì)胞的增殖活性無顯著影響，但能使原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性明顯下降。射線照射能使兩種細(xì)胞的增殖活性顯著降低。聯(lián)合照射組中，與組相比，細(xì)胞的增殖活性無明顯變化，原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中組增殖活性顯著升高。（）微波和丫射線照射后，細(xì)胞的凋亡率有上升的趨勢，聯(lián)合照射后，上升更明顯，其中組有統(tǒng)計學(xué)差異。各處理組的壞死率均增高，與組相

3、比，、和各聯(lián)合組有統(tǒng)計學(xué)意義。聯(lián)合組與組相比，組的凋亡率顯著升高，各聯(lián)合組的壞死率均顯著升高。對于原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與組相比，和組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，組與組相比無明顯變化；各處理組細(xì)胞的壞死率無明顯差異。（）單獨微波照射后原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活性無顯著變化，射線照射后，活性明顯增強。（）與組相比，單獨微波照射后，細(xì)胞的期、期和期均沒有顯著變化。射線照射后，期和期比例降低，其中組的期和、組的期明顯下降，、和組的期比例明顯增加。與組相比，聯(lián)合組的各期比例未見顯著變化。對于原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與組相比，各處理微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)中文摘要組的期無顯著變化，和組的期比例明顯降低，期比例明

4、顯升高；與組相比，組細(xì)胞各期無顯著變化。（）細(xì)胞和原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)微波、射線和聯(lián)合照射處理后，均顯著升高。與組相比，細(xì)胞的和組升高有統(tǒng)計學(xué)差異。兩種細(xì)胞的與其凋亡率之間均呈現(xiàn)出直線相關(guān)關(guān)系。（）對于細(xì)胞，與組相比，各處理組的均明顯下降，與組相比，和組顯著下降。原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)微波、丫射線和聯(lián)合照射處理后，與對照組相比均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。（）細(xì)胞經(jīng)微波、丫射線和聯(lián)合照射處理后，¨礦酶活性降低，其中組和各組有統(tǒng)計學(xué)差異。與組相比，組的酶活性明顯升高。對于原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，各處理組的酶活性顯著降低。結(jié)論：（）低強度微波和丫射線能對細(xì)胞產(chǎn)生損傷效應(yīng)，微波可在一定程度上加強射線的效應(yīng)。（）

5、低強度微波表現(xiàn)出對原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖抑制作用，未表現(xiàn)出對丫射線的協(xié)同或抑制效應(yīng)。（）胞漿內(nèi)超載、線粒體膜電位的下降和酶活性的降低可能是微波加強射線對細(xì)胞損傷反應(yīng)的機制之一。關(guān)鍵詞：微波、射線、增殖活性、凋亡、活性、細(xì)胞周期、寸、酶作者：陸敏霞指導(dǎo)教師：童建教授微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)英文摘要：（），、（）（，），）、，（）（）（）：礦（）：（）丫（），（）（），（），塒微波與丫射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)英文摘要（），（），：（），（），（），。：；：；：微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)中英文縮略語對照表中英文縮略語對照表極低頻電磁場艘曲射頻電磁場高頻電磁場一微波脫

6、氧核糖核酸線粒體膜電位磷酸鹽緩沖液碘化丙碇乳酸脫氫酶多聚賴氨酸凋亡誘導(dǎo)因子低強度微波流式細(xì)胞儀三磷酸腺苷甲基四氮唑磷脂酰絲氨酸異硫氰酸熒光素水溶性四氮唑核糖核酸酶線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔激光共聚焦顯微鏡蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)聲明學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。研究生簽名：群叢數(shù)趣日期：掣：！二

7、！蘭學(xué)位論文使用授權(quán)聲明蘇州大學(xué)、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所、國家圖書館、清華大學(xué)論文合作部、中國社科院文獻(xiàn)信息情報中心有權(quán)保留本人所送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。除在保密期內(nèi)的保密論文外，允許論文被查閱和借閱，可以公布（包括刊登）論文的全部或部分內(nèi)容。論文的公布（包括刊登）授權(quán)蘇州大學(xué)學(xué)位辦辦理。研究生導(dǎo)師簽日期：芝世日期：型聲業(yè)微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)引言引言在眾多的環(huán)境和職業(yè)有害因素中，電磁輻射越來越受到社會的關(guān)注。電磁輻射是一非常廣泛的概念，包括電離輻射和非電離輻射，其中非電離輻射的波譜覆蓋

8、很寬的頻率和波長。電磁輻射的頻譜可由甚低頻到極高頻（），和人們健康密切相關(guān)的電磁輻射主要包括極低頻電磁場（，）和射頻電磁場（，），射頻電磁場又包括高頻電磁場（，）和微波（，）。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，微波被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、通訊、醫(yī)療、軍事及日常生活中，但因而也成為威脅人類健康的隱患之一。電離輻射主要見于戰(zhàn)時核爆炸，也見于輻射事故、臨床上腫瘤放射性治療等。微波和射線的聯(lián)合暴露常見于一些特殊的作業(yè)環(huán)境；臨床腫瘤放射治療中，也存在射線和微波的聯(lián)合暴露。隨著微波定向武器的出現(xiàn)，未來的戰(zhàn)爭中軍事人員甚或平民遭受微波和電離輻射聯(lián)合照射的可能性明顯增加。因此，微波和電離輻射的聯(lián)合作用已成為需要關(guān)注的公共衛(wèi)

9、生問題之一。微波是一種頻率在至之間的電磁波，它具有波動性、高頻性、熱特性和非熱特性四大基本特征。微波能夠穿透到生物組織內(nèi)部，使偶極分子和蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈以極高的頻率振蕩，增加分子的運動，并可導(dǎo)致熱量的產(chǎn)生。微波還能夠?qū)滏I、疏水鍵和范德瓦爾斯鍵產(chǎn)生作用，使其重新分配，從而改變生物大分子的構(gòu)象與活性【】。微波的生物學(xué)效應(yīng)是微波的重要特性之一，它在醫(yī)學(xué)、理療學(xué)和手術(shù)學(xué)等方面有廣泛的應(yīng)用。微波按其波長可分為個波段：分米波、厘米波、毫米波。目前常用的是與微波，其波長屬于分米波波段。微波是物理治療學(xué)中常用的超高頻治療波段。微波與生物組織的相互作用，是建立在微波對細(xì)胞作用的基礎(chǔ)上，主要包括兩個方面：熱效應(yīng)

10、和非熱效應(yīng)【。當(dāng)生物體或組織中的極性分子特別是水分子和蛋白質(zhì)分子受到微波照射時，在外加交變電磁場的作用下，這些分子就會隨外電場的頻率而發(fā)生周期性的電極矩轉(zhuǎn)動，分子碰撞和摩擦將電磁能轉(zhuǎn)換成熱能，引起溫度的升高。微波的頻率越高，產(chǎn)生的熱量也就越大【】。微波所產(chǎn)生的熱效應(yīng)因微波與，射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)引言輻射的強度與時間而異，一般呈線性關(guān)系。產(chǎn)生熱效應(yīng)的閾值為，最強的熱效應(yīng)產(chǎn)生于，輻射停止后，組織溫度恢復(fù)到原有水平】。高功率微波輻射生物體一定時間后，組織因吸收微波能量而溫度升高，引起一系列生物學(xué)改變。如生理、生化和形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞膜通透性改變、酶的失活、蛋白質(zhì)變性及激素形成異常，最終導(dǎo)致

11、組織細(xì)胞的損傷。一般認(rèn)為：微波輻射功率密度不超過為低強度微波（，），它對人體主要產(chǎn)生非熱生物學(xué)效應(yīng)【】，即機體接受微波輻射后產(chǎn)生不屬于溫度升高而引起的生物學(xué)改變。非熱效應(yīng)表現(xiàn)在組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平各個層次上。在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平上，可導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞膜通透性增加、酶活性下降、合成抑制以及染色體斷裂等，尤其是增殖旺盛的細(xì)胞更為敏感【】。在微波的作用下，生物體的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)可同時存在。在高強度微波輻射場中，主要表現(xiàn)為熱效應(yīng)。而在長時間、低功率輻射場下，微波的非熱效應(yīng)占主導(dǎo)地位隅。射線是一種電離輻射，可對生物分子產(chǎn)生直接作用，也可以通過水的激發(fā)和電離的間接作用，引起強烈而復(fù)雜的生物學(xué)

12、效應(yīng)。對應(yīng)前者的有靶學(xué)說，對應(yīng)后者的有自由基學(xué)說。根據(jù)靶學(xué)說，細(xì)胞內(nèi)存在對射線特別敏感的結(jié)構(gòu)和分子，即作用靶，射線對細(xì)胞的損傷是通過對靶的作用實現(xiàn)的。電離輻射擊中靶的概率服從泊松統(tǒng)計規(guī)律，對不同的靶，電離輻射發(fā)生效應(yīng)的概率大小不同。按照自由基學(xué)說，被激發(fā)和電離的靶分子和水分子常常形成多種自由基。孤對電子結(jié)構(gòu)決定了自由基非?；顫姷幕瘜W(xué)反應(yīng)能力，因此丫射線等電離輻射對生物大分子的損傷主要發(fā)生在自由基的化學(xué)作用階段，通過產(chǎn)生自由基而使生物分子發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的變化引。從上述可知，微波輻射的生物效應(yīng)是建立在對極性分子和基團電磁作用基礎(chǔ)上，而丫射線輻射的生物效應(yīng)是建立在對分子和基團的激發(fā)和電離作用，特別是

13、通過自由基為中介的基礎(chǔ)上。微波和電離輻射本質(zhì)上都是電磁輻射，只是在能量或頻率上有所不同，通過相干性和協(xié)同性，表現(xiàn)出生物效應(yīng)的多樣性。到目前為止，對非電離輻射（微波輻射）和電離輻射（射線）的聯(lián)合生物效應(yīng)及其機理研究還很少，而且對聯(lián)合效應(yīng)的一些報道還存在矛盾和分歧。國內(nèi)王中和等【】利用丫射線和高功率密度的毫米波聯(lián)合照射人舌癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)射線聯(lián)合高功率微波輻射能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力（抑瘤率為），且明顯高于單純丫射線組（抑瘤率為）和微波組（抑瘤率為）。沈世人等認(rèn)為時的微波不微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)引言僅能減輕鈷射線所造成的小鼠的損傷，而且能夠促進(jìn)放射損傷后骨髓造血功能的恢復(fù)。在

14、生物整體水平上，電磁輻射主要引起神經(jīng)系統(tǒng)改變，神經(jīng)細(xì)胞是其作用的主要靶點【。神經(jīng)系統(tǒng)由兩類細(xì)胞組成，即神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人類的常見腫瘤之一，臨床上常用放射性治療。本課題選用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作為研究微波聯(lián)合丫射線照射的細(xì)胞模型，觀察二者的聯(lián)合效應(yīng)，為制定科學(xué)的環(huán)境輻射防護標(biāo)準(zhǔn)和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分第一部分微波聯(lián)合射線照射對神經(jīng)，勺損傷效應(yīng)隨著微波技術(shù)的廣泛應(yīng)用，低強度微波（）輻射對健康的影響正日益引起人們的關(guān)注，微波輻射對生物體具有廣譜的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是其非致熱效應(yīng)【。微波和電離輻射抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞發(fā)生凋亡

15、已經(jīng)被大量研究所證樊】。微波無論通過熱效應(yīng)或非熱效應(yīng)均能使細(xì)胞生長受到抑制。微波可以協(xié)同射線增加其對細(xì)胞增殖的抑制作用【¨。微波的非熱效應(yīng)使細(xì)胞分裂指數(shù)下降、合成抑制、細(xì)胞周期阻滯、改變細(xì)胞膜的通透性，影響酶的活性【】。本部分實驗采用人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以細(xì)胞增殖活性、凋亡率和乳酸脫氫酶（）活性為測試指標(biāo)，以頻率為、功率密度為、的微波單獨及聯(lián)合丫射線照射為處理因素，探討低強度微波輻射及微波與丫射線聯(lián)合照射的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。材料和方法材料和儀器主要試劑及物品培養(yǎng)基、培養(yǎng)基：美國公司新生牛血清：胎牛血清：杭州四季青公司多聚賴氨酸（）、胰蛋白酶（）：羥乙基呱嗪乙磺酸（）、

16、谷氨酰胺：、：上海國藥凋亡檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司乳酸脫氫酶（）測試盒：南京建成生物工程研究所青、鏈霉素（）上海生工儀器設(shè)備恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱：倒置相差顯微鏡：酶聯(lián)免疫檢測儀：公司微波與，射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分可調(diào)微量移液器、離心機：公司電子天平（）：刪超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠培養(yǎng)皿、孔板、孔培養(yǎng)板（平底）：公司信號源：北京森馥科技有限公司圖像分析系統(tǒng)：，暴露系統(tǒng)：東南大學(xué)設(shè)計制造微波功率場強儀：公司流式細(xì)胞儀：公司射線放射源：由蘇州大學(xué)輻照中心提供紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司型常用溶液的配制培養(yǎng)液：將袋

17、粉末溶于升新處理的三蒸水中，每升加入、及谷氨酰胺，將調(diào)至，加入青、鏈霉素至終濃度為，¨微孔濾膜抽濾除菌。無菌試驗后，保存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)液：將袋粉末溶于升新處理的三蒸水中，配置方法同培養(yǎng)液。新生牛血清、胎牛血清：，水浴滅活，無菌條件下分裝，保存?zhèn)溆谩Ｈ芤海?，。，溶入三蒸水中，將調(diào)至，高壓滅菌，保存?zhèn)溆?。液：，溶入三蒸水中，將調(diào)至，高壓滅菌，保存?zhèn)溆?。胰蛋白酶（）：稱粉狀胰蛋白酶，溶于消毒過的中，岬微孔濾膜過濾除菌，分裝，保存，備用。胰蛋白酶（）：稱粉狀胰蛋白酶，溶于消毒過的中，岬微孔濾膜過濾除茵，分裝，一保存，備用。馓被與射線聯(lián)合照射對神細(xì)胞的損傷教鷹第一蚱分微波特征微波頻率為星一圖電磁輻

18、射裝置示意圖，連續(xù)性微波（）。微波強度測定細(xì)胞微波照射前，對電磁輻射裝置照射野進(jìn)行測量，以得到目的微波強度的區(qū)域（圖）。圖分別顯示、和：區(qū)域微波強度檢測的實時值和的持續(xù)值，圖中可以看出該照射裝置可作為持續(xù)穩(wěn)定的微波發(fā)射源。測量所得的微波電場強度（）通過式【】換算為磁場強度（）?！尽课⒈慌c射線聯(lián)臺月時對神勤胞的損傷遺生第一部分；。：。蠢一；。二基?！眻D各照射強度電場強度實時值（左）和電場強度持續(xù)監(jiān)測值（右）】（）（曲細(xì)胞培養(yǎng)和傳代人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（）的培養(yǎng)和傳代人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（）取自本教研室的細(xì)胞凍存懸液。將凍存管在（水浴鍋中迅速解凍、融化，、離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入含小

19、牛血清的培養(yǎng)液；復(fù)蘇后細(xì)胞系轉(zhuǎn)入、培養(yǎng)箱中孵育：當(dāng)培養(yǎng)瓶底約”的面積被細(xì)胞鋪滿時，用胰蛋白酶消化傳代。多次傳代培養(yǎng)直至培養(yǎng)出足夠量的合格細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代取新生的乳鼠（蘇卅大學(xué)實驗動物中心提供），用乙醇浸泡消毒皮膚，斷頭，無菌條件下用眼科剪小心剪開頭骨后再用眼科鑷取出雙微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分側(cè)大腦皮質(zhì)置于盛有液的培養(yǎng)皿內(nèi)，小心剝離腦膜和血管組織，將大腦皮質(zhì)移至另一個盛有適量培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，切碎大腦皮質(zhì)成糜狀，加無血清培養(yǎng)基吹打成懸液，用目的細(xì)胞篩過濾，離心、，棄上清，用含血清培養(yǎng)基（胎牛血清）重懸后，置（、培養(yǎng)箱中差速粘附處理，以去除成纖維

20、細(xì)胞成分，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸取細(xì)胞懸液接種至預(yù)先包被過（濃度為）的玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，置入、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨后內(nèi)靜置培養(yǎng)瓶，后換液，換液一次，培養(yǎng)至第，細(xì)胞融合后胰蛋白酶消化傳代。傳代前先用力振蕩培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，用液清洗次，然后用胰蛋白酶于培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞變圓后加入新的含血清培養(yǎng)基終止消化，充分吹打，接種于新的培養(yǎng)瓶中，傳代后進(jìn)行后續(xù)實驗。分組照射細(xì)胞的分組照射取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化懸浮，個細(xì)胞皿接種，每皿中加入培養(yǎng)液。將細(xì)胞隨機分為（對照組）、和單獨微波組及與丫射線聯(lián)合暴露組，分別記為組（、）和組（、），每組設(shè)三個平行樣。第天細(xì)胞貼壁后將單純微波組和聯(lián)合暴露組放入電磁輻照系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行

21、輻照，連續(xù)照射，組和組同時放入同一房間的輻照系統(tǒng)外。第天組再接受的丫射線照射，丫射線采用輻照，照射劑量，劑量率為。具體分組如表。表細(xì)胞的分組其中為對照組，、和為單獨微波組，為單獨射線組，、和為聯(lián)合暴露組微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分組照射取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化懸浮，個細(xì)胞接種，每皿中加入培養(yǎng)液。參考細(xì)胞的分組照射，進(jìn)行細(xì)胞存活率的檢測，根據(jù)細(xì)胞存活率的檢測結(jié)果，從三個劑量的微波組中篩選出一個微波劑量（），后續(xù)實驗將細(xì)胞隨機分為對照組（），微波組（），丫射線組（）及聯(lián)合組（），照射方案參考細(xì)胞。具體分組如表。表原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分組其中為對照組，為單獨

22、微波輻射組，為單獨丫射線組，為聯(lián)合照射組細(xì)胞計數(shù)和密度計算收集培養(yǎng)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度不低于個枷），充分混勻后取少量細(xì)胞懸液輕輕注入計數(shù)板小室，并充滿計數(shù)板和蓋玻片的間隙。在顯微鏡下，用物鏡觀察、計數(shù)。按式【】計算細(xì)胞密度。細(xì)胞密度（個）每小格平均細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)細(xì)胞增殖活性的檢測比色實驗是一種快速高靈敏度的檢測細(xì)胞存活和生長的方法；試劑中含有，是一種類似于的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臌染料，而死細(xì)胞無此功能。生成的甲躦物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比；細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；使用可檢測細(xì)胞的增殖活性。將細(xì)

23、胞以個孑的密度接種于孔板中，每孔加培養(yǎng)液。將原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以個孔的密度接種于孔板中，每孔加培養(yǎng)液。第二天細(xì)胞貼壁后開始輻照，輻照結(jié)束后將孔板中的培養(yǎng)液輕輕吸出，每孔加入山的培養(yǎng)液和的試劑，輕柔吹打混勻，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育后將上清液轉(zhuǎn)移至孔板中，每孔設(shè)三個平行孔，于主波長，副】微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分波長處測定吸光度的值。細(xì)胞增殖活性的計算公式見式【】：細(xì)胞增殖活性【】式中：實驗組吸光度的值；一對照組吸光度的平均值；細(xì)胞凋亡的測定于輻照結(jié)束后消化收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的，充分洗滌細(xì)胞，、離心收集細(xì)胞，兩次；加入“結(jié)合緩沖液，輕柔吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入山和山溶液，充分混勻

24、后，于避光反應(yīng)。同時以只加溶液和只加溶液染色作為對照校正。將測試樣品和對照組上流式細(xì)胞儀檢測分析。乳酸脫氫酶（）活性的檢測能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與，二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯肼，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。于輻照后，取原代膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測，測定方法按照試劑盒說明。統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（士）表示，運用分析軟件進(jìn)行方差分析及檢驗。為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)首次接種的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一般在貼壁，折旋光性較好，部分細(xì)胞開始鋪展，長出細(xì)長的胞突。后，主要以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，還有少量的少突角質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和極少量的成纖維細(xì)胞。隨著

25、傳代培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物中的膠質(zhì)細(xì)胞的比例逐漸增加，以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主，而神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞的比例逐漸減少。星形膠質(zhì)細(xì)胞在底層互相連接成網(wǎng)狀（圖）。傳代后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例增多，形態(tài)結(jié)構(gòu)更加突出。相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征：胞體較大而扁，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)較豐富，細(xì)胞核圓形或卵圓形，常偏于胞體的一側(cè)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞突尤其是初級胞突較多較長，呈放射狀。鍤泣與射線聯(lián)臺射對神釋細(xì)胞的摜協(xié)效應(yīng)第一部分躅原代皎質(zhì)細(xì)月皂的傳代培養(yǎng)（）：原代培養(yǎng)第九天的腔質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞連接成網(wǎng)狀（×）；：傳代培齊第十五天的細(xì)胞，星形腔質(zhì)知胞的比倒增多星彤突起明呈，呈放射狀連接成網(wǎng)狀（×）：傳代培養(yǎng)第二十一

26、天的細(xì)胞，知照辟積增大，胞，太而扁，星形突起明顯，形狀不規(guī)則連接成網(wǎng)狀（×）；微波廈聯(lián)合射線照射對細(xì)胞增殖活性的影響由表可見，各劑量微波組的細(xì)胞增殖活性與對照組（）相比未見無明顯變化，單獨射線組和聯(lián)合暈露組的增殖活性均顯著降低。原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞各娃理組的增殖活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（尸）。與單獨射線組（）相比，細(xì)胞各聯(lián)合組的增殖活性無顯著變化，而原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞各聯(lián)合組的增殖活性有升高的趨勢，其中以聯(lián)合組升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（尸）。微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分表微波及聯(lián)合射線照射對細(xì)胞增殖活性的影響（，±），（，±）丫。（）（）吁（

27、）士士士。±士士棗與組相比，；撐與組才目比，從圖（、）可以看出，單獨微波輻射對細(xì)胞的增殖活性未產(chǎn)生明顯影響，但可抑制原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性。丫射線能顯著抑制兩種細(xì)胞的增殖活性。丫射線照射前給予不同劑量的低強度微波輻射，對細(xì)胞的增殖活性無明顯影響，但可減輕射線對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用，其中的微波聯(lián)合組較顯著。圖船一單獨微波組（勸聯(lián)合照射組（，）（微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分圖一單獨微波組（）、一聯(lián)合照射組（）盆鈾號蠱薔。（）圖微波及聯(lián)合丫射線照射對細(xì)胞增殖活性的影響（：細(xì)胞；：原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）（：；：）微波及聯(lián)合丫射線照射對細(xì)胞凋亡和壞死的影響由表可見，

28、微波和丫射線照射后，細(xì)胞的凋亡率有上升的趨勢，聯(lián)合照射后，上升更明顯，其中組有統(tǒng)計學(xué)差異（氏）。各處理組的壞死率均增高，其中單純微波組緩慢增高，而聯(lián)合照射組升高顯著，與相比，各組均有統(tǒng)計學(xué)意義（）。對于原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，微波和丫射線照射均可增加凋亡率，和組增加顯著；而各處理組細(xì)胞的壞死率無明顯差異。微波與射線聯(lián)合照身于對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分表微波及聯(lián)合射線照射對細(xì)胞凋亡和壞死的影響（，吐），）（，與組相比，；群與組相比，從圖可以看出，低強度微波和丫射線照射后細(xì)胞的凋亡率有上升的趨勢，但差異不明顯，在丫射線照射前給予不同強度的微波輻射，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增多，且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。微波和射線照

29、射均可引起細(xì)胞的壞死率增加，且在丫射線照射前給予不同強度的微波輻射，細(xì)胞的壞死率增加更加明顯，但未表現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系。微波和丫射線照射可誘導(dǎo)原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，但在丫射線照射前給予微波輻射，可使細(xì)胞的凋亡率降低。各種處理因素對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的壞死率無明顯影響。微波與射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)圖疆第一部分靜一單獨微波組壞死率聯(lián)舍照射組壞死率一一單獨微波組凋亡率聯(lián)合照射組凋亡率，、圖廠、一一單獨微波組凋亡率聯(lián)合照射組凋亡率（確圖微波及聯(lián)合丫射線照射對細(xì)胞凋亡和壞死的影響（：細(xì)胞；：原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）；：）（：流式細(xì)胞儀檢測報告如圖示，散點圖被分為四個象限：左上象限（，）為壞死細(xì)胞、裸核細(xì)胞

30、及其碎片，右上象限（，）為凋亡晚期細(xì)胞，左下象限為活細(xì)胞（一，），右下象限（，）為凋亡早期細(xì)胞。圖中縱軸表示熒光強度，橫軸表示熒光強度。微被射線聯(lián)合射對神女細(xì)胞的損傷教應(yīng)第一部分蕾瓣縛麟糕辮。鑭簿麟鱒黼懿墼塾皇！堅些壁魚堅盟！壁絲！些塑！塹塾堡苧二堅坌呻圖流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測圖（：細(xì)胞；：原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞）（：；：）微波及聯(lián)合射線照射對原代神經(jīng)肢質(zhì)細(xì)胞活性的影響由表可見，各處理組的活性有升高的趨勢，與對照組（）相比組有統(tǒng)計學(xué)差異（，）。與組相比，組細(xì)胞的活性有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異?；挣蹬c射線聯(lián)臺照射對神經(jīng)細(xì)胞的摜坼教第一部分表微波及聯(lián)合射線照射時原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活生的影響（，）（，十）

31、（）（）（）（）與組相比。從圖可以直觀看出，微波照射能輕度增強細(xì)胞活性：射線照射能顯著增強細(xì)胞的活性，在射線照射前給予微渡照射可增強細(xì)胞的活性。曰單獨懶渡組（神聯(lián)臺照射組（口）罩蠶¨（，）嶼組相，圖微波廈聯(lián)合射線照射對原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞乳酸脫氫酶（）活性的影響蟹（）微波與，射線聯(lián)合照射對神經(jīng)細(xì)胞的損傷效應(yīng)第一部分討論微波通過分子間振動等形式作用于生物體，產(chǎn)生熱或非熱生物效應(yīng)。、射線是頻率的電磁輻射，屬于電離輻射，通過電離和激發(fā)將能量傳遞給被作用物質(zhì)而產(chǎn)生生物效應(yīng)。微波是目前日常生活中應(yīng)用較多的頻率（如醫(yī)療儀器、微波爐等），人類暴露的機會不斷增加，對其低劑量非致熱效應(yīng)的危害尚不明確。為人

32、源性星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞團】，屬惡性瘤細(xì)胞。它的惡性程度高，增殖迅速，研究表明有較強的輻射抗性【】。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（）是神經(jīng)系統(tǒng)的間質(zhì)細(xì)胞，分布在神經(jīng)元之間，是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量眾多的一大類細(xì)胞群體，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)（）細(xì)胞總數(shù)的。內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞（），以及少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞（）和小膠質(zhì)細(xì)胞（）。神經(jīng)系統(tǒng)許多疾病與膠質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)，如帕金森病時腦損傷區(qū)出現(xiàn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。星形膠質(zhì)細(xì)胞功能發(fā)生紊亂時，細(xì)胞外【柚異常升高，可引起局部神經(jīng)元興奮性增高而導(dǎo)致癲癇發(fā)作。本實驗取材新生的大鼠，原代培養(yǎng)后傳代，傳至第四代用于后續(xù)實驗時，星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度可達(dá)以上口。本研究對微波以及聯(lián)合射線照射時，

33、兩種細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的異同進(jìn)行了比較。對兩種細(xì)胞增殖活性的影響本實驗條件下，微波照射對細(xì)胞的增殖活性沒有明顯影響，但能抑制原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性，提示兩種細(xì)胞的輻射敏感性不同。周欣榮等報道頻率為、強度為的微波照射對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的增殖活性沒有明顯影響【】。但姜槐等人發(fā)現(xiàn)頻率為、強度為的微波對晶狀體上皮細(xì)胞能產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用【。由于為腫瘤細(xì)胞，增殖迅速，低強度的微波不足以導(dǎo)致其增殖活性的降低。馬敬等人用、的微波輻照人鼻咽癌細(xì)胞時，未觀察到其增殖活性明顯下降，但強度為和的微波卻出現(xiàn)了增殖活性顯著降低】。另一方面，丫射線照射對兩種細(xì)胞的增殖活性均有抑制作用。張元鵬等人發(fā)現(xiàn)以上的照射劑

34、量在后可顯著抑制體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性【】，劉建軍等報道的低劑量在內(nèi)也能持續(xù)抑制原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的增殖活性【。此次實驗中，觀察到預(yù)先給予一定劑量的低強度微波，可以減輕丫射線對原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖抑制作用。微波和射線的聯(lián)合效應(yīng)比較復(fù)雜，一般認(rèn)為在電離輻射后的急性作用期給予微波與，射線聯(lián)合照射對神經(jīng)勻胞的損傷效應(yīng)第一部分微波照射，多使效應(yīng)加重，但在電離輻射前給以微波照射，卻可使效應(yīng)減輕【，與本次實驗結(jié)果一致。對兩種細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響細(xì)胞的死亡方式分壞死和凋亡兩種。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙參數(shù)分析，即可將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞區(qū)分開來。各種細(xì)胞在發(fā)生凋亡的早期，細(xì)胞膜上的成分之一，磷脂酰絲氨酸（）會發(fā)生重新分布，即細(xì)胞膜內(nèi)表面的翻轉(zhuǎn)，發(fā)生不可逆的外露，這種改變明顯早于核內(nèi)的固縮、變性和裂解。熒光素標(biāo)記的蛋白可與結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，用于檢測早期凋亡；而熒光素碘化丙啶（）不能通過完整的細(xì)胞膜，可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光，可用于檢測壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞的存在。使用與雙染色法，可加強凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞的區(qū)分度，從而能