流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理

1、FLOW CYTOMETRY流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。 原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒)的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介 流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer ）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀特點(diǎn)特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的分類(lèi)流

2、式細(xì)胞儀的分類(lèi) 分析型流式細(xì)胞儀 細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。 分選型流式細(xì)胞儀 既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選； 進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。BD公司產(chǎn)品 FACS Calibur雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高 FACSAria 科研型分選流式細(xì)胞儀FACS Vantage DiVa科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：多數(shù)字化適用用各類(lèi)細(xì)胞分選4路分選Beckman Coulter流式細(xì)胞儀Epics XL 單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型Galli

3、os 三激光十色，分析型MoFlo XDP 高端分選型第一節(jié) 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液(sheath)。 流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液鞘液鞘液細(xì)胞流細(xì)胞流激光照射點(diǎn)激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)樣速率控制 通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)

4、節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。 高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。光學(xué)原理散射信號(hào)散射信號(hào)與與熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng)熒光波長(zhǎng))Emission wavelength激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)Excitation wavelen

5、gthLongpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成： 光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。 前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。 模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。光電檢測(cè)器(photodetector) 光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（FSC）； 光電倍增管(photomultiplier, PMT)光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光

6、前向散射光光電二極管光電二極管 光信號(hào)的類(lèi)型：散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)， 是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forward scatter, FSC);側(cè)向散射光(side scatter, SSC).熒光信號(hào)自發(fā)熒光 ：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出 的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。流式細(xì)胞分析的信息光信號(hào)檢測(cè)流式細(xì)胞的基本信息流式細(xì)胞的基本信息: “形態(tài)形態(tài)”散射光的作用 實(shí)驗(yàn)中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片流式細(xì)胞的主要信息:Fluoresc

7、enceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合 Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1-綠色 FL2-、橙色 FL3-紅色 FL4-紅色488FL1BP 530/30515-545nmFITC（綠色，520nm）FL2BP 585/42564-606nmPEFL3670 LP670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）635FL4BP 661/16653-669nmAPC（紅色，660nm）流式常見(jiàn)圖形 (Histogram Plot)適用于：

8、單參數(shù)分析適用于：?jiǎn)螀?shù)分析DNA倍體分析倍體分析抗原表達(dá)分析抗原表達(dá)分析流式常見(jiàn)圖形 (Dot Plot)散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖偽彩圖 假三維圖和三維圖SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 等高圖和密度圖 等高圖：類(lèi)似于地圖中的等高線(xiàn)，同一條線(xiàn)上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線(xiàn)代表細(xì)胞數(shù)目越多。 密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。設(shè)門(mén)與數(shù)據(jù)分析 門(mén)(Gate，簡(jiǎn)寫(xiě)G)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過(guò)程實(shí)際上就是選門(mén)和設(shè)門(mén)的過(guò)程。橢圓形橢圓形圓形圓形十字門(mén)十字門(mén)線(xiàn)性門(mén)線(xiàn)性門(mén)流式分選 電荷式分選超聲振動(dòng)器(15-100kHz)液

9、流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置(流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)(充電充電)高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用分析群體細(xì)胞所需時(shí)間短多參數(shù)分析定性或定量流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍 細(xì)胞大小 細(xì)胞的顆粒度 細(xì)胞表面分子：CD 系列等 細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等 細(xì)胞核內(nèi)分子：P53 細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、PH、Ca+、細(xì)胞活性等 樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞 懸液 標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析繼續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理 單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化 抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng) 非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體細(xì)胞染色

10、細(xì)胞染色 染色要求： 特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群 非特異反應(yīng)水平低 抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本 使用特異的單克隆抗體 最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體 采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物 抗體最適滴度抗體的選擇 首選直接標(biāo)記抗體 熒光分子：PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原 間接標(biāo)記：適用范圍廣, biotin-avidin不適 合弱抗原的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì) 空白對(duì)照：ALL 陰性對(duì)照：評(píng)估非特異反應(yīng)水平，界定陰性范圍 常用同型抗體對(duì)照 單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照） 多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照 （用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管 陽(yáng)性對(duì)照：確定抗原

11、表達(dá)正常時(shí)的抗原表達(dá)強(qiáng)度和百分含量。（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡分析淋巴細(xì)胞表面抗原分析 樣本來(lái)源 新鮮抗凝全血 PBMC 單克隆熒光抗體染色 溶血 洗細(xì)胞 固定 上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析 樣本來(lái)源 新鮮抗凝全血 PBMC 細(xì)胞表面抗體染色 溶血、固定 細(xì)胞打孔 細(xì)胞內(nèi)抗體染色 上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期分析：G1MG2SQuiescent cellsG0n處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA，G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。nDNA熒光染料能與DNA結(jié)合，D

12、NA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過(guò)流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例。樣品制備樣品制備上機(jī)DNA 流式檢測(cè)的主要指標(biāo) DNA 含量: ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量 DI：測(cè)定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞DNA含量與同種系正常細(xì) 胞的G0/G1期細(xì)胞DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性 PI：增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例 CV： G0/G1期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)Annexin V Assay （建議用于懸浮細(xì)胞）在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，一旦發(fā)生細(xì)胞凋亡，可以從細(xì)胞膜的內(nèi)

13、側(cè)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，使得PS 暴露在細(xì)胞膜表面。在Ca2+存在時(shí)，Annexin V 與PS 有很高的親和力，可與之迅速結(jié)合。PS 外翻發(fā)生在細(xì)胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得Annexin V 與PS 的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測(cè)標(biāo)志事件。PI 被用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與annexin V-FITC 和PI 結(jié)合顯色，而PI 則被排除在活細(xì)胞(FITC 陰性)和早期凋亡細(xì)胞(FITC 陽(yáng)性)之外。 Annexin V-FITC/ PI雙染色法雙染色法雙陰：活細(xì)胞 Annexin V-FITC單陽(yáng)：早期凋亡細(xì)胞雙陽(yáng)：晚期凋亡

14、細(xì)胞 PI 單陽(yáng)：壞死細(xì)胞PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。Annexin V-FITCAnnexin V-FITCPIPI活細(xì)胞活細(xì)胞早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期凋亡壞死細(xì)胞壞死細(xì)胞裸核裸核進(jìn)樣速率控制 通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并通過(guò)改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。 高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變

15、異系數(shù)增加。電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成： 光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。 前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。 模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。 Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) FL1-綠色 FL2-、橙色 FL3-紅色 FL4-紅色488FL1BP 530/30515-545nmFITC（綠色，520nm）FL2BP 585/42564-606nmPEFL3670 LP670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（紅色）635FL4BP 661/16653-669nmAPC（紅色，660nm）等高圖和密度圖 等高圖：類(lèi)似于地圖中的等高線(xiàn)，同一條線(xiàn)上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線(xiàn)代表細(xì)胞數(shù)目越多。 密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的