流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用hiv圖文

1、 白細(xì)胞的組成及其分化抗原白細(xì)胞的組成及其分化抗原白細(xì)胞在分化成熟過程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類的白細(xì)胞白細(xì)胞在分化成熟過程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類的白細(xì)胞出現(xiàn)或消失的表面標(biāo)記，這是區(qū)分白細(xì)胞的重要標(biāo)志。出現(xiàn)或消失的表面標(biāo)記，這是區(qū)分白細(xì)胞的重要標(biāo)志。1986年年世界衛(wèi)生組織命名委員會建議應(yīng)用世界衛(wèi)生組織命名委員會建議應(yīng)用CD系列來統(tǒng)一命名白細(xì)胞分系列來統(tǒng)一命名白細(xì)胞分化抗原化抗原SHA- LF4N 13E for Jerel細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞;分泌穿孔素、IFN、TNF等。特點(diǎn)：MHC-1類分子限制、直接接觸、反復(fù)殺傷自然殺傷細(xì)胞（NK)：抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的

2、細(xì)胞毒作用、淋巴因子介導(dǎo)細(xì)胞毒作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用補(bǔ)體系統(tǒng)的活化（經(jīng)典、凝集素、替代途徑）。作用（溶胞作用、吞噬條理作用、趨化性、 炎癥反應(yīng)等）中和抗原：形成免疫復(fù)合物，被吞噬細(xì)胞清除（條理作用）、毒素中和作用、感染中和作用淋巴因子依賴的細(xì)胞毒作用 免疫應(yīng)答：細(xì)胞免疫體液免疫Th細(xì)胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可誘導(dǎo)Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B細(xì)胞活化，產(chǎn)生抗體B細(xì)胞完全活化需要Th幫助 流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry) 對于處在流動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)的快速的分析和定量的技術(shù)BDBD

3、公司公司HIVHIV領(lǐng)域流式細(xì)胞儀產(chǎn)品領(lǐng)域流式細(xì)胞儀產(chǎn)品FACSCount流式細(xì)胞儀FACSCalibur流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀檢測原理及在T細(xì)胞分析中應(yīng)用激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物FACSCaliburFACSCalibur流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu) 液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 軟件系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)-鞘液鞘液流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理 Injector Tip熒光信號及前向角、側(cè)向角散射光聚焦的激光光束鞘液光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光 (Laser, light amplification by stimulated em

4、ission of radiation)是一種相干光源，它能提供單一波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照 激光波長: 488nm, 635nm檢測信號檢測信號 散射光信號散射光信號FSC: FSC: 前向角散射光前向角散射光SSC: SSC: 側(cè)向角散射光側(cè)向角散射光(90(90度散射光度散射光) ) 熒光信號熒光信號熒光染料熒光染料光學(xué)濾片光學(xué)濾片檢測信號檢測信號FALS SensorLaser前向角散射光信號前向角散射光信號 前向角散射光信號前向角散射光信號 FSC-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的檢測器, 為前向散射光檢測器 FSC的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒

5、的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān) FSC用于檢測細(xì)胞或其他粒子的表面屬性如:大小 FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號側(cè)向角散射光信號 SSC-Side (Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器, 也稱為90度散射光檢測器 SSC的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān) SSC用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)如:胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比 流式細(xì)胞儀的檢測信號：散射流式細(xì)胞儀的檢測信號：散射光光 FSC，前向角散射光，代表細(xì)胞大小

6、 SSC，側(cè)向角散射光，代表細(xì)胞粒度Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source 每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長, 并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細(xì)胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長. 利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測)這些光學(xué)信號光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成 長通濾片 允許長于設(shè)定波長的光通過 短通濾片 允許短于設(shè)定波長的光通過 帶通濾片 允許一定帶寬的波長通過460 500 5

7、40460 500 540460 500 540 長通 短通 帶通光學(xué)濾片光學(xué)濾片熒光信號熒光信號熒光信號熒光信號 當(dāng)以 45o 角放置長通濾片時(shí),該濾片可以通過一定波長的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長以下的光 這種方式的濾片稱為二向色性長通濾片( dichroic filter) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物, 通過激光照射區(qū)時(shí), 受激激發(fā), 產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號, 這些信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號, 送計(jì)算機(jī)進(jìn)行儲存、 作圖、 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)射波長發(fā)射波長Wavelength (nm)40045050055060065070010008006004

8、002000PEFITCPerCP750流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理 熒光信號650nm700nmFL3650 and Above500nm600nmFL1530/30FL2585/42Relative IntensityFITCPEPerCPWavelength (nm)550nm Photomultiplier tube (PMT) 將光學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號 單平臺絕對計(jì)數(shù)單平臺絕對計(jì)數(shù) 管中預(yù)先加有準(zhǔn)確定量的Beads 流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)后，由各目標(biāo)群的含量，可以計(jì)算出相對含量% 由各目標(biāo)群與Beads的相對量計(jì)算，得到該細(xì)胞群的絕對含量 計(jì)算公式： 細(xì)胞獲取數(shù)Beads總

9、量細(xì)胞/L= Beads獲取數(shù) 樣本量注：Beads總量見TruCOUNT管外包裝MultiSET系統(tǒng)中，樣本量為50 L單平臺絕對計(jì)數(shù)單平臺絕對計(jì)數(shù) 使用TriTEST或MultiTEST試劑，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù) TruCOUNT管中預(yù)先加有準(zhǔn)確定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致 由各目標(biāo)群與Beads的相對量計(jì)算，得到該細(xì)胞群的絕對含量 使用直接熒光標(biāo)記抗體組合，一步處理外周血 使用免洗技術(shù)，溶血后直接上機(jī)檢測標(biāo)本 操作簡便，省時(shí)省力，計(jì)數(shù)結(jié)果重復(fù)性好淋巴細(xì)胞分析淋巴細(xì)胞分析 使用特異的單克隆抗體，進(jìn)行多色分析，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞上多種

10、抗原的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，進(jìn)行定量分析 淋巴細(xì)胞分析 TriTEST：三色試劑CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45 MultiTEST ：四色試劑CD3/CD8/CD45/CD4 TruCOUNT：單平臺絕對計(jì)數(shù)管 報(bào)告Th,Ts,Th/Ts 百分含量%與絕對含量cells/uLTriTEST CD4/CD8/CD3hT Lymph EventshCD3+CD4+ %T LymphhCD3+CD8+ %T LymphhCD3+ CD4+CD8+%T LymphhT H/S RatiohBead EventshCD3+ Abs CnthCD3+CD4+ Abs CnthC

11、D3+CD8+ Abs CnthCD3+CD4+CD8+ Abs Cnt淋巴細(xì)胞四色分析淋巴細(xì)胞四色分析hLymph Abs CnthCD3+ % LymphCD3+ Abs CnthCD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+ Abs CnthCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs CnthCD3+CD4+CD8+%LymphhCD3+CD4+CD8+ Abs CnthT H/S RatioMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19FacsCalibur儀器樣本操作儀器樣本操作 儀器校正：加入校正試劑內(nèi)

12、的液體必須和鞘液桶的一樣。 樣本操作：溶血、有凝塊的血不要做 加樣前，抗凝血顛倒混勻810次（避免混勻器混勻） 使用反向加樣法，槍頭貼壁。加樣槍在試管內(nèi)不要放松 FACSComp沒有通過怎么辦？沒有通過怎么辦？FSC或SSC沒有通過：原因：1.由于儀器的管路沒有清洗干凈2.使用的鞘液雜質(zhì)太多(換鞘液）BD公司專用鞘液3.校準(zhǔn)品失效4.儀器故障措施：1. 用蒸餾水高速運(yùn)行儀器10分鐘30分鐘2. 過濾鞘液3. 使用新的校準(zhǔn)品4. 致電BD工程師FacsCalibur儀器儀器 BD原裝鞘液：過濾、消毒。0.22um濾膜過濾 鞘液桶放入3升鞘液（不要放滿），清除廢液桶廢液，裝200毫升漂白劑 先開儀

13、器再開電腦 在按Prime按鈕去除流動(dòng)池氣泡時(shí)，上樣架處在偏離位置 做好每日維護(hù)，建議每次關(guān)機(jī)時(shí)做FacsClean和FacsRinse清洗。 （1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分鐘；支架正位3分鐘 （2） FacsRinse，步驟同上 （3）蒸餾水， Run Hi2分鐘旁位，5分鐘正位（4）去除鞘液壓力（5）選擇Standby模式10分鐘后關(guān)機(jī) 月維護(hù)中鞘液桶裝入FacsClean (0.51的漂白劑)，旁路鞘液過濾器。 每3個(gè)月6個(gè)月清洗空氣過濾網(wǎng)（用水沖洗再晾干）。過濾器6個(gè)月更換FACSCount儀器性能 樣本穩(wěn)定性 制備后室溫(2025 0C)儲存48小時(shí) 全血穩(wěn)定

14、性 采集后室溫(2025 0C )儲存48小時(shí)FacsCount樣本處理樣本處理 FacsCount質(zhì)控：正常血，樣本用前顛倒混勻（避免 混勻器上混勻）。反向加樣法，槍頭貼管壁,分離最后一滴。 試劑在開蓋前可以在混勻器上顛倒混勻 每次更換槍頭，樣本多時(shí)，每次更換試劑對管管蓋 加入固定液后30分鐘以后再操作更安全FacsCount儀器儀器 用水沖洗開蓋器，用輕柔的去污劑或70酒精清洗電子 加樣槍,用1：10的漂白劑清洗Workstation 避免在廢液桶里裝高濃度的漂白劑 每次試驗(yàn)結(jié)束后廢液桶必須清空,然后用自來水沖洗.建議關(guān)機(jī)后取出廢液桶,下次實(shí)驗(yàn)時(shí)再放置在儀器里 電子加樣槍不用時(shí)需從支架上取

15、下. 軟盤復(fù)制（已做過質(zhì)控的軟盤作為母盤） 連續(xù)做15個(gè)標(biāo)本需要做清洗，如果試驗(yàn)中間中斷1小時(shí) 以上，需要清洗；將裝有蒸餾水的上樣管置于上樣針位置， 保持上樣針濕潤，防治結(jié)晶；關(guān)機(jī)。 如果長時(shí)間不做試驗(yàn)，建議每周用蒸餾水清洗FacsCount儀器儀器 FacsCount的每日維護(hù)； 1.運(yùn)行CLEAN程序， 2.上樣管放置稀釋的FacsClean（稀釋10倍次氯酸鈉） 3分鐘 3.再放置裝有FacsRinse（Tween 稀釋10倍1/00%)上樣管清洗3分鐘 4.重新執(zhí)行CLEAN程序，F(xiàn)acsRinse （Tween 稀釋10倍1/00%)再洗3分鐘 5.放置裝有蒸餾水的上樣管清洗3分鐘

16、6.試驗(yàn)結(jié)束后，放置裝有蒸餾水的上樣管浸泡上樣針，避免管道結(jié)晶 6.儀器無用時(shí)建議取出廢液桶FacsCount儀器儀器 FacsCount的長沖洗； 1.短路過濾器,并在鞘液桶內(nèi)和試管中放置稀釋5倍的次氯酸鈉 2.運(yùn)行CLEAN程序(二個(gè)循環(huán))后進(jìn)入U(xiǎn)TILITY程序，按“Shutdown”鍵，使上樣針浸泡在裝有次氯酸鈉的試管中，將儀器電源關(guān)掉，讓儀器管道浸泡30分鐘 2.倒掉鞘液桶內(nèi)的次氯酸鈉，將鞘液桶洗干凈，換上干凈的（蒸餾水或純凈水），試管中換上蒸餾水或純凈水，再運(yùn)行清洗程序一個(gè)循環(huán)，執(zhí)行排氣泡“Drain”命令兩次 3.恢復(fù)鞘液接頭和過濾器的接頭到原來位置，排除過濾器內(nèi)的空氣，再次運(yùn)行

17、CLEAN程序（一個(gè)循環(huán)），和排氣泡“Drain”. 4.試驗(yàn)結(jié)束后，裝有蒸餾水的上樣管浸泡上樣針，避免管道結(jié)晶聯(lián)系方式技術(shù)支持：趙陽陽郵箱：sunny_電話件工程師：李晨電話國技術(shù)維修服務(wù)電話：4008199900-2謝謝 謝謝BD生物科學(xué) 免疫應(yīng)答：細(xì)胞免疫體液免疫Th細(xì)胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可誘導(dǎo)Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B細(xì)胞活化，產(chǎn)生抗體B細(xì)胞完全活化需要Th幫助 流式細(xì)胞儀檢測原理及在T細(xì)胞分析中應(yīng)用FACSCaliburFACSCalibur流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu) 液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng) 電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 軟件系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)單平臺絕對計(jì)數(shù)單平臺絕對計(jì)數(shù) 使用TriTEST或MultiTEST試劑，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù) TruCOUNT管中預(yù)先加有準(zhǔn)確定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致 由各目標(biāo)群與Beads的相對量計(jì)算，得到該細(xì)胞群的絕對含量 使用直接熒光標(biāo)記抗體組合，一步處理外周血 使用免洗技術(shù)，溶血后直接上機(jī)檢測標(biāo)本 操作簡便，省時(shí)省力，計(jì)數(shù)結(jié)果重復(fù)性好FacsCount儀器儀器 FacsCount的每日維護(hù)； 1