PCR技術(shù)(原理、分類、步驟及主要試劑、設(shè)備準備)(共5頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）原理DNA的半保留復(fù)制時，雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗條件下，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性 - 退火(復(fù)性）- 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板D

2、NA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板 - 引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)分類（常用）（1）反向PCR技術(shù)(Inve

3、rse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA后酶切片段自身環(huán)化以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴增夾在中間的未知序列。該擴增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段 。（2）錨定PCR技術(shù)(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進行擴增

4、, 稱為APCR。（3）不對稱PCR技術(shù)(asymmetric PCR)：兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對稱PCR。在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度, 常用50100÷1比例。在最初的1015個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA, 但當?shù)蜐舛纫锉幌谋M后, 高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNA。（4）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(reverse transcription PCR, RT-PCR)：當擴增模板為RNA時, 需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行擴增。應(yīng)用非常廣泛, 無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗等都經(jīng)常采用。（5）巢式PCR技術(shù)(NEST-PCR)：先用一對靶

5、序列的外引物擴增以提高模板量, 然后再用一對內(nèi)引物擴增以得到特異的PCR帶, 此為巢式PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCR。為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些, 且用量較少, 同時在第一次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度, 這樣在第一次PCR時, 由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合, 故只有外引物擴增產(chǎn)物, 經(jīng)過若干次循環(huán), 待外引物基本消耗盡, 無需取出第一次PCR產(chǎn)物, 只需降低退火即可直接進行PCR擴增。這不僅減少操作步驟, 同時也降低了交叉污染的機會。這種PCR稱中途進退式PCR，主要用于極少量DNA模板的擴增。（6）多重PCR

6、技術(shù)(multiplex PCR)：在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴增幾種基因片段,如果基因的某一區(qū)段有缺失,則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會消失。主要用于同一病原體的分型及同時檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。（7）重組PCR技術(shù)：重組PCR技術(shù)是在兩個PCR擴增體系中, 兩對引物分別由其中之一在其5-端和3-端引物上帶上一段互補的序列,混合兩種PCR擴增產(chǎn)物,經(jīng)變性和復(fù)性,兩組PCR產(chǎn)物互補序列發(fā)生粘連,其中一條重組雜合鏈能在PCR 條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng),產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。（8）原位PCR技術(shù)：利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細胞的前

7、提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增，可進行細胞內(nèi)定位，適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。（9）熒光定量實時PCR技術(shù)反應(yīng)動力學(xué) PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升，最終DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算，Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平均每次的擴增效率，n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率理論值為100%，但實際情況達不到，反應(yīng)初期靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，此效應(yīng)稱平臺期，與DNA聚合酶

8、數(shù)量和活性、PCR擴增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。PCR擴增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分，短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短、長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是長產(chǎn)物片段。進入第二個反應(yīng)周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（長產(chǎn)物片段）結(jié)合引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，故這次延伸的片段3端被固定了止點，保證了新片段的起點、止點都限定于引物擴增的序列以內(nèi)

9、，形成長短一致的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可忽略不計，使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需再純化既可以保證足夠純的DNA片段供分析、監(jiān)測。反應(yīng)五要素 - 引物、模板、DNA聚合酶、四種dNTP、Mg2+（1）引物設(shè)計 ？引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，引物自身連續(xù)互補堿基不能超過3個，一對引物間也不易多于四個連續(xù)堿基的互補性。 【引物的GC含量和Tm值

10、應(yīng)該協(xié)調(diào)：Tm=4（G+C）+2（A+T）】避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3端為關(guān)鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進行任何修飾，也不能形成二級結(jié)構(gòu)的可能，一般3端也不能發(fā)生錯配，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 5端無嚴格限制，只起限定PCR產(chǎn)物長度的作用，對擴增特異性影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物

11、量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。（2）DNA聚合酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量0.5-2.5 U/50 ml，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 （3）dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP

12、降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。 （4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙

13、醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。（5）Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。RT-PCR - 是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。總RNA提?。?70保存）Trizol法：1、取組織100于玻璃勻漿器中，加入1ml Trizol 冰上抽打勻漿（邊勻漿邊暫停）2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存

14、5min3、加氯仿0.2ml（總體積的1/5），振蕩混合，室溫放置5min4、4，離心12000 rpm，15min 5、取上層液相（約400l）移入一新1.5ml EP管中，加等體積異丙醇（約400l）,振蕩混合，室溫保存10min6、4，離心12000 rpm，10min7、棄上清液，加1ml 75%無水乙醇（4保存），振蕩混合8、4，離心7500 rpm，5min9、棄上清液，室溫放置20min(EP管倒置在濾紙上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（ 可保存在液氮或低溫冰箱-70）測RN

15、A濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值調(diào)零：750ul DEPC水測量：745ul DEPC水 + 5ul RNA總RNA濃度= OD260×40×稀釋倍數(shù)（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×6 ug/ulA1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間注意：提取RNA的質(zhì)量主要是要通過260/280的比值看是不是在2.0左右，當OD260/OD280<1.8時提示有蛋白或酚的污染，需要進一步純化RNA；還要跑膠看看28s、18s、5s的三條帶是不是清晰，一般質(zhì)

16、量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一條5s的應(yīng)該比較淡。逆轉(zhuǎn)錄RT（cDNA：一周內(nèi)-20保存，長期-70保存）RT反應(yīng)體系：20ul體系第一步：約20分鐘RNA抽提物 5lRadome引物 2lRNAsin 0.5l1、65 15分鐘 2、立即放入冰浴 第二步：約2小時RNAsin 0.5l10mM dNTP 1l5× RT緩沖液 4l25mM MgCl2 4l AMV 3l1、37 1.5小時 2、94 5-10分鐘 3、反應(yīng)物保存于-20或進行PCR聚合酶鏈反應(yīng)PCR(產(chǎn)物-20保存)PCR反應(yīng)體系：100l體系 約4.5小時 約5小時25mM MgCl2

17、 2l 3l10×PCR緩沖液 5l 5l10mM dNTP 1l 1l10pmol/l上游引物 2.5l 2.5l10pmol/l下游引物 2.5l 2.5lcDNA模板 2.5l 5lddH2O 34l 30lTaq酶 0.5l 1l輕質(zhì)石蠟油 50l 50l1、94 2分鐘，55 1分鐘，72 2分鐘 為第一個步1個循環(huán) 2、94 45秒，55 40秒，72 1分鐘 為第二步30/40個循環(huán) 3、72 10分鐘 4、取出后4保存，5分鐘后-20保存或走電泳 瓊脂糖凝膠電泳：約1.25小時1、配制0.5× TBE電泳緩沖液300 ml 2、配制凝膠濃度1.7%（40ml

18、 0.5×TBE加0.68g膠），微波爐中火2分鐘溶解膠，冷卻至60加入溴乙錠2l（10mg/ml的終濃度0.5g/ml），充分混勻3、將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進行電泳4、加樣8l PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2l溴酚蘭 ，空一格加DNA marker5、電泳50-80V ，電場強度不宜高于5V/cm6、在紫外燈下觀察,DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系 統(tǒng)拍照保存。電泳緩沖液(5×TBE貯存液)：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用時，將5×TBE稀釋10倍成0.5×TBE就可以在電泳時使用(工作濃度)。上樣緩沖液(6×緩沖液，4保存)：0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF、30%甘油瓊脂糖凝膠配制：（1.0%）1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰(如果首次煮膠，一定要煮透，以不出現(xiàn)泡沫為標志)，熔化的瓊脂物冷卻至60時加入10mg/ml溴化乙錠5l，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快瓊