硅酸鹽細(xì)菌菌種

1、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)                  NY 8822004     硅酸鹽細(xì)菌菌種 Silicate-Dissolving Bacteria Culture  2005-01-04 發(fā)布         2005-02-01 實(shí)施   中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 

2、; 發(fā)布  前    言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D和附錄E為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:農(nóng)業(yè)部微生物肥料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：曹鳳明、李俊、沈德龍、姜昕、葛一凡。 硅酸鹽細(xì)菌菌種1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了農(nóng)用硅酸鹽細(xì)菌菌種的特征、要求、檢驗(yàn)方法、評(píng)價(jià)方法以及菌種的純化、復(fù)壯和保藏。本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)用微生物菌劑和微生物肥料生產(chǎn)中使用的硅酸鹽細(xì)菌菌種。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用

3、于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 17419-1998      含氨基酸葉面肥料 NY/T 301-1995        有機(jī)肥料速效鉀的測(cè)定NY/T 798-2004        復(fù)合微生物肥料3術(shù)語硅酸鹽細(xì)菌菌種 Silicate-Dissolving Bacteria Culture 是指一類在

4、土壤中能通過自身的生命活動(dòng)，分解硅鋁酸鹽類礦物，釋放鉀素營養(yǎng)，改善植物的營養(yǎng)條件，并具備生產(chǎn)應(yīng)用性能的細(xì)菌純培養(yǎng)物。4菌種特征硅酸鹽細(xì)菌菌種包括膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）兩個(gè)種。4.1細(xì)胞形態(tài)營養(yǎng)體：粗長桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色反應(yīng)不定，產(chǎn)生聚-羥基丁酸鹽（PHB）顆粒。在培養(yǎng)基A.1上(參見附錄A)菌體大小為（1.01.2）×（2.57.0）m，菌體周圍有厚莢膜。芽孢：壁厚，橢圓形，中生或近端生，芽孢囊不膨大或微膨大。4.2菌落形態(tài)在A.1培養(yǎng)基平板上：菌落圓形，無色，隆起，膠質(zhì)粘稠，透明或半

5、透明，邊緣整齊。4.3生物學(xué)特征好氧或兼性厭氧生長，水解淀粉，接觸酶反應(yīng)陽性，氧化酶和卵磷脂酶反應(yīng)陰性，在無氮培養(yǎng)基（參見附錄A.2）上生長良好，生長溫度1045。5要求5.1 菌種要求純培養(yǎng)物，無雜菌。5.2 硅酸鹽細(xì)菌菌種技術(shù)指標(biāo)見表1。表1     硅酸鹽細(xì)菌菌種技術(shù)指標(biāo)項(xiàng)  目指  標(biāo)解鉀能力-速效鉀相對(duì)增加量，  %20發(fā)酵代謝產(chǎn)物植物激素總量，    mg/L1.0游離氨基酸總量，  mg/L50.0有機(jī)酸總量，     

6、mg/L500.0耐熱能力-芽孢存活率，      %70發(fā)酵周期，         h606檢驗(yàn)方法6.1菌種純度檢驗(yàn)在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落和菌體形態(tài)，若有雜菌丟棄或?qū)ζ溥M(jìn)行純化，純化方法見 8.1.2  。6.2解鉀能力的測(cè)定速效鉀相對(duì)增加量的測(cè)定方法見附錄B。6.3發(fā)酵代謝產(chǎn)物測(cè)定 6.3.1發(fā)酵條件在適宜培養(yǎng)條件下，發(fā)酵周期結(jié)束后取樣測(cè)定發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的含量。以不接種的發(fā)酵培養(yǎng)液作對(duì)照。發(fā)酵培養(yǎng)基見附錄A.3。6.3.2植物激素的測(cè)定見附錄

7、C。6.3.3游離氨基酸的測(cè)定 見附錄D。6.3.4有機(jī)酸的測(cè)定 見附錄E。6.4芽孢存活率測(cè)定6.4.1測(cè)定方法菌懸液在65條件下恒溫30min殺死營養(yǎng)體，制成芽孢懸液。芽孢懸液80恒溫水浴處理10min，將處理前和處理后的芽孢懸液稀釋涂布在適宜培養(yǎng)基上，適宜條件下培養(yǎng)2d4d，計(jì)菌落數(shù)。三次重復(fù)。活菌數(shù)測(cè)定方法應(yīng)符合NY/T 798-2004中5.3.2的要求。6.4.2芽孢存活率計(jì)算按式(1)計(jì)算                &

8、#160;     (1)式中: - 芽孢存活率（% ）n0 - 處理前芽孢懸液的菌落平均數(shù)（cfu/mL）n1  - 處理后芽孢懸液的菌落平均數(shù)（cfu/mL）6.5發(fā)酵周期的檢驗(yàn)適宜生產(chǎn)條件下，當(dāng)發(fā)酵液中的菌體數(shù)量達(dá)到108cfu/mL以上且有80%以上的營養(yǎng)體形成芽孢為發(fā)酵周期終止。7評(píng)價(jià)方法7.1菌株符合表1中的各項(xiàng)指標(biāo)，可以作為優(yōu)良生產(chǎn)菌株。7.2表1中其他三項(xiàng)符合要求，而發(fā)酵代謝產(chǎn)物僅兩項(xiàng)達(dá)到要求或其中一項(xiàng)達(dá)到要求的兩倍，也可作為生產(chǎn)菌株。7.3當(dāng)硅酸鹽細(xì)菌菌種用做生產(chǎn)液體劑型時(shí)，對(duì)耐熱能力不做要求。8菌種純化、復(fù)壯和保藏

9、8.1菌種分離與純化8.1.1分離將土壤或其他樣品制成菌懸液，稀釋后涂布A.1培養(yǎng)基平板上，適宜條件下培養(yǎng)2d4d，挑取符合硅酸鹽細(xì)菌菌種特征的菌落進(jìn)行純化。8.1.2純化在適宜的培養(yǎng)基上連續(xù)劃線培養(yǎng)觀察，直至菌落形態(tài)一致，鏡檢菌體大小整齊，無雜菌。根據(jù)硅酸鹽細(xì)菌的特征進(jìn)行菌種確認(rèn)。8.2復(fù)壯菌種生長速度下降、菌體形態(tài)出現(xiàn)異常、主要功能指標(biāo)下降時(shí)需要進(jìn)行菌種復(fù)壯。具體操作方法是將菌種接種在適宜的土壤或載體中，也可將菌種轉(zhuǎn)接在含有土壤浸出液的培養(yǎng)基上23代；培養(yǎng)一段時(shí)間后再分離，挑取與原菌種特征一致的菌落，純化，同時(shí)按表5.1中的要求進(jìn)行測(cè)試。8.3菌種保藏8.3.1短期保藏常用的保藏方法是斜面

10、保藏法，挑選菌苔豐滿無污染的斜面菌種置于48下保存，三個(gè)月左右轉(zhuǎn)接一次。8.3.2長期保藏 菌種形成芽孢后進(jìn)行長期保存，采用兩種或兩種以上的方法保存，并制備多個(gè)備份。常采用的保藏方法有：凍干管法，甘油管法，石蠟油覆蓋法，砂土管法等。      附錄A（資料性附錄）選擇培養(yǎng)基A.1硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基蔗糖5.0gNa2HPO42.0 gMgSO4 · 7H2O0.5 gCaCO30.1 gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.58.5瓊脂18.020.0 g蒸餾水1.0 LA.2無氮培養(yǎng)基（阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基

11、）甘露醇10.0gKH2PO40.2gMgSO4· 7H2O0.2gNaCl0.2gCaCO35.0gCaSO4· 2H2O0.1gpH7.07.5瓊脂18.020.0 g蒸餾水1.0 LA.3測(cè)定發(fā)酵代謝產(chǎn)物用發(fā)酵培養(yǎng)液玉米淀粉8.0g豆餅粉2.0 gK2HPO42.0gMgSO4 · 7H2O0.5gMnSO4 · H2O0.5 gCaCO30.1gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.07.5蒸餾水1.0 L 附錄B（資料附錄）解鉀能力測(cè)定B.1原理硅酸鹽細(xì)菌能夠分解硅鋁酸鹽礦物，將礦物態(tài)鉀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄遭洖榫w自身或植物所利用，通過測(cè)

12、定培養(yǎng)液中速效鉀含量的相對(duì)增加量來確定菌種的解鉀能力。B.2材料和試劑B.2.1材料含鉀礦石粉：鉀長石，磨碎，粒徑0.075mm以下。B.2.2試劑20% H2O2 溶液B.3培養(yǎng)液B.3.1種子液淀粉5.0g酵母膏1.0 gK2HPO42.0gMgSO4· 7H2O0.5gCaCO30.1gFeCl3 · 6 H2O5 mgpH7.58.5蒸餾水體積1.0 LB.3.2發(fā)酵液蔗糖10.0gMgSO4· 7H2O0.5g(NH4)2· SO40.2gNaCl0.1gCaCO30.1g鉀長石粉5.0gpH7.27.5蒸餾水體積1.0 LB.4測(cè)定方法步驟B

13、.4.1鉀礦石處理鉀礦石粉用20%HCl溶液淋洗（酸洗，洗去速效鉀和緩效鉀），再用蒸餾水淋洗至中性。B.4.2種子液制備挑取一環(huán)活化好的斜面菌種接入50mL種子培養(yǎng)液中，150r/min 搖床，適宜溫度下培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，菌體含量不少于2×108cfu/mL。B.4.3發(fā)酵液制備500mL三角瓶加入解鉀發(fā)酵液95mL，高壓滅菌備用。接入種子液5 mL，同時(shí)做加入等量滅活種子液的發(fā)酵液為對(duì)照，在28、150r/min條件下培養(yǎng)7d。設(shè)置三個(gè)重復(fù)。B.4.4發(fā)酵液的處理 過氧化氫灰化法將全部發(fā)酵液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，在水浴鍋中濃縮至10mL左右，加2.0mLH2O2溶液，繼續(xù)蒸發(fā)，并不斷攪動(dòng)，反復(fù)

14、加20%H2O2溶液幾次至粘性物質(zhì)完全消化。3500 r/min 離心10min，將上清液收集在50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，然后測(cè)定溶液中速效鉀含量。B.4.5速效鉀的測(cè)定按 NY/T 301-1995 規(guī)定執(zhí)行。對(duì)第6章試樣的制備、第7章分析步驟中的7.1和7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制進(jìn)行修改。B.4.5.1試樣的制備 按 B.4.4 的要求執(zhí)行。B.4.5.2分析步驟試樣溶液制備 參見NY/T 301-1995 7.1，將稱取試樣5.00g 改為吸取試樣5.00mL。吸取鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液 0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.50，10.00 mL分別置于8個(gè)50mL容量瓶中。加1

15、0.00mL 硝酸溶液，用水定容。此溶液1mL中含鉀（K）0，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，15.00，20.00g的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。在火焰光度計(jì)上用空白溶液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中的最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)儀器滿刻度至80分度處，測(cè)量其他標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄儀器示值。根據(jù)鉀濃度和儀器示值繪制校準(zhǔn)曲線或求出直線回歸方程。B.5速效鉀相對(duì)增加量按式（2）計(jì)算                  

16、0;   （2）式中：a  速效鉀相對(duì)增加量（%）0 試樣中速效鉀的含量（mg/L）（未接種發(fā)酵液的對(duì)照）1 試樣中速效鉀的含量（mg/L）（接種發(fā)酵液） 附錄C（資料性附錄）發(fā)酵液中植物激素的測(cè)定C.1原理植物生長素赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）和細(xì)胞分裂素玉米素（Z）、異戊烯基腺嘌呤（IPA）等嘌呤衍生物都溶于甲醇，可用甲醇提取發(fā)酵液中的植物激素。植物生長素和細(xì)胞分裂素的分子結(jié)構(gòu)不同，在反相C18柱上保留時(shí)間不同，調(diào)整流動(dòng)相中各組分的比例，可使各組分定量分離。因此采用反相液相色譜法可對(duì)植物生長素和細(xì)胞分裂素定量測(cè)定。C.2試劑乙腈：色譜純。甲醇：優(yōu)級(jí)純并

17、經(jīng)0.5m濾膜過濾。植物激素標(biāo)準(zhǔn)品：色譜純。磷酸：優(yōu)級(jí)純。水重蒸并經(jīng)0.45m濾膜過濾。植物生長素標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取植物生長素標(biāo)準(zhǔn)品(赤霉素GA3，吲哚乙酸IAA)各0.0020g（±0.0001），用甲醇溶解并定容至25.0mL；細(xì)胞分裂素標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取細(xì)胞分裂素標(biāo)準(zhǔn)品（玉米素Z，異戊烯基腺嘌呤IPA等）各0.0040g（±0.0001）,用甲醇溶解并定容至25.0mL.C.3儀器高效液相色譜儀（HPLC），具紫外檢測(cè)器。C.4測(cè)定方法C.4.1生長素C.4.1.1試樣制備取10.00mL發(fā)酵液于50mL錐形瓶中，減壓濃縮干后，加入50mL冷甲醇在5左右進(jìn)行超聲波中振

18、蕩2h，經(jīng)0.5m濾膜過濾，濾液待測(cè)。C.4.1.2色譜條件a.     色譜柱：C18, 0.4cm×25 cmb.     流動(dòng)相：15%CH3CN40%CH3OH45%H2O（用H3PO4調(diào)pH至4.0）c.     檢測(cè)器：UV254nm×0.1AUFSd.     進(jìn)樣量：10Le.     流速：0.7mL/minC.4.1.3標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定在上述色譜條件下，吸取生長

19、素標(biāo)樣溶液10L進(jìn)樣分析，得到GA3、IAA色譜圖，記錄各組分保留時(shí)間和峰面積。重復(fù)進(jìn)樣三次，取各組分峰面積平均值。C.4.1.4試樣溶液測(cè)定在同一色譜條件下，吸取試樣溶液10L進(jìn)行分析，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各組分含量。C.4.1.5計(jì)算外標(biāo)法定量按（3）式計(jì)算               （3）式中：1 樣品中生長素的總量（mg/L）i  樣品中第i種生長素的含量（mg/L）V1   樣品量（mL）V2   

20、; 樣品定容體積（mL）C.4.2細(xì)胞分裂素的測(cè)定C.4.2.1試樣制備按C.4.1.1 的規(guī)定執(zhí)行。C.4.2.2色譜條件a.       色譜柱： C18, 0.4cm×25cmb.       流動(dòng)相：15%CH3CN25%CH3OH60%H2O（用H3PO4調(diào)pH至3.5）c.       檢測(cè)器：UV254nm×0.1AUFSd.     

21、;  進(jìn)樣量：20Le.       流速：0.7mL/min  C.4.2.3標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定按C.4.1.3的規(guī)定執(zhí)行。C.4.2.4試樣溶液測(cè)定按C.4.1.4的規(guī)定執(zhí)行。C.4.2.5計(jì)算外標(biāo)法定量按（4）式計(jì)算                    （4）式中：2 樣品中細(xì)胞分裂素的總量（mg/L）i  樣品中第

22、i種細(xì)胞分裂素的含量（mg/L）V1   樣品量（mL）V2    樣品定容體積（mL）C.5植物激素的總量植物激素的總量為植物生長激素與細(xì)胞分裂素之和。按（5）式計(jì)算                      （5）式中：  植物激素的總量（mg/L）1 植物生長激素的總量（mg/L）2  細(xì)胞分裂素的總量（mg/L） 附錄D

23、（資料性附錄）發(fā)酵液中游離氨基酸的測(cè)定D.1原理試劑 儀器設(shè)備見 GB/T 17419-1998 4.1.1，4.1.2，4.1.3。D.2分析步驟D.2.1試樣溶液的制備取試樣（發(fā)酵液）2.0mL于10mL離心管中，加入5%磺基水楊酸鈉2.0mL，混勻，放置1h，使蛋白質(zhì)沉淀。再加入EDTA溶液1.0mL和鹽酸溶液1.0mL，離心機(jī)離心15min，取上清液1.0mL于5mL的容量瓶中，蒸干，用1.0mL（pH2.2）的緩沖液溶解，待測(cè)。D.2.2試樣空白溶液的制備空白試樣溶液除不加試樣外，用相同試劑溶液，按D.2.1 規(guī)定的步驟進(jìn)行。D.2.3測(cè)定準(zhǔn)確吸取0.20mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，用pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,作為上機(jī)測(cè)定的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測(cè)定試樣溶液氨基酸含量。D.2.4計(jì)算外標(biāo)法定量按式（6）計(jì)算： 或     （6）式中： 樣品中游離氨基酸總量（mg/L）ni 進(jìn)樣體積V3中第i種氨基酸的量（nmol）Mi 第i種氨基酸分子量mi 進(jìn)樣體積V3中第i種氨基酸的質(zhì)量（ng）V1 樣品量（mL）