腎康注射液與苯那普利對腎小球系膜基質(zhì)作用的對比研究

1、    腎康注射液與苯那普利對腎小球系膜基質(zhì)作用的對比研究             作者：佚名時間：2007-11-22 11:17:00                     內(nèi)容提要目的：探討腎康注射液與苯那普利對人腎小球系膜細(xì)胞外基

2、質(zhì)(ECM)不同成分的抑制作用強度。方法：采用體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞技術(shù)，觀察具有降逆泄?jié)?、益氣活血功效的中藥腎康注射液及苯那普利對ECM不同成分的影響。結(jié)果：腎康注射液具有抑制ECM成分中纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)和型膠原(Col )的作用，該抑制作用具有一定的量效關(guān)系。苯那普利對ECM中FN、Col 也有一定的抑制作用，但不及腎康注射液作用明顯。結(jié)論：腎康注射液對ECM的抑制作用優(yōu)于苯那普利。 Contrast Study on Effect of Shenkang Injection and Benazepril on Human Glomerular Mesangia

3、l Extracellular Matrix  Objective: To explore the intensity of inhibition of Shenkang Injection (SKI) and Benazepril on various ingredients of human glomerular mesangial extracellular matrix (ECM).Methods: Effect of SKI, a herbal preparation for lowering adverse Qi, despelling turbidness, suppl

4、ementing Qi and activating circulation, and Benazepril were observed by cultured glomerular mesangial cell technique in vitro.Results: SKI could inhibit the fibronetin, laminin, and type collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit the fibronetin and type collage

5、n of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of SKI was superior to Benazepril in inhibiting ECM. collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit&nb sp;the fibronetin and type collagen of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of S

6、KI was superior to Benazepril in inhibiting ECM. Key wordsShenkang Injection, Benazepril, mesangial cell, extracellular matrix 腎小球疾病具有進(jìn)行性加重的特征，而且各種類型的腎小球疾病發(fā)展的最終結(jié)果都表現(xiàn)為腎小球硬化的形成。腎小球硬化是多種原因引起腎小球損傷后出現(xiàn)的共同轉(zhuǎn)歸，是慢性腎功能衰竭(CRF)的主要病理基礎(chǔ)。近年來，隨著對腎小球硬化機制認(rèn)識的不斷深入，腎小球系膜細(xì)胞(MC)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)及各種細(xì)胞因子在腎功能進(jìn)行性減退過程中所起的作用倍受關(guān)注。抑制MC增

7、殖，減少ECM的堆積，拮抗細(xì)胞因子的不良作用，已成為防治腎小球硬化，延緩CRF病情進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。本研究采用人腎小球MC體外培養(yǎng)技術(shù)，觀察了具有降逆泄?jié)?、益氣活血功效的腎康注射液對ECM中纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)及型膠原(Col )含量的影響，并以苯那普利作為陽性對照，冀從細(xì)胞水平探討其延緩腎小球硬化的作用強度及作用機制。 材料與方法 1材料 1.1腎組織來源系我校附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科孕5月引產(chǎn)胎腎。 1.2藥物與試劑腎康注射液(SKI)由大黃、丹參、紅花等組成，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，每毫升含原生藥0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號：0

8、12200；V型膠原酶、HEPES均系Sigma產(chǎn)品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰島素均為美國GIBCO產(chǎn)品；小鼠抗人單克隆FN抗體、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均購于北京中山生物技術(shù)有限公司；LN、Col 放射免疫分析試劑盒，均購于上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心。 1.3主要儀器CO2孵箱(TYPE4型)德國HERAEUS公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡(TOKYO)日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；潔凈工作臺(月壇牌)北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠生產(chǎn)；酶標(biāo)分析儀(MODEL2550)美國BTO-RAD公司生產(chǎn)；FT-613自動計數(shù)125 I放免測量儀，北京核儀器廠生產(chǎn)。 2MC培養(yǎng)與鑒定無菌取胎腎，分離提取腎皮

9、質(zhì)小球組織，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的單個腎小球進(jìn)行原代和繼代培養(yǎng)，實驗中使用傳代5代的MC。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫病理鑒定證實為單純的MC，無上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞及成纖維細(xì)胞污染。 3分組及MC上清的收集吸取培養(yǎng)的第5代MC培養(yǎng)瓶中液體，加胰酶1ml，置孵箱(5% CO2、37)中消化3min，加10% FCS 1640終止液2ml，抽吸于離心管中，800rpm，離心3min，棄上清，加15% FCS 1640培養(yǎng)液于離心管中，吹打，混勻。用計數(shù)板計數(shù)后，傾入加樣槽中，用8導(dǎo)加樣槍，按每孔200l，密度4000/孔鋪板。將96孔板按列從左至右依次分為空白對照組(簡稱組)、苯那普利組(簡稱組

10、)、腎康注射液高濃度組1、2(簡稱組、組)、腎康注射液中濃度組1、2(簡稱組、組)、腎康注射液低濃度組1、2(簡稱組、組)，共8組(列)，每列6孔，待細(xì)胞貼壁24h后，每孔加無血清1640培養(yǎng)液200l同步24h。除空白對照組外，其余各組分別依次加入苯那普利103mmol/L及腎康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125g/ml，待刺激48h后依次收集上清待測。 4測定ECM中FN的含量用雙抗體夾心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗體原液用包被緩沖液稀釋1000倍。取96孔板，50l/孔鋪板，4過夜，甩去。用PBS吐溫20洗滌液洗板3次，每次3min，間隔2min，控

11、干。每孔加1%BSA封閉液100l，37，1h后甩去，控干。依次按組各孔分別加入待測上清50l，37，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS11000稀釋)50l/孔，室溫放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS 11000稀釋)50l/孔，室溫放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD顯色液50l，預(yù)熱酶標(biāo)儀，用2M H2SO4終止液50l/孔終止，立即在492nm波長讀數(shù)，并記錄OD值。 5ECM中LN、Col 含量的放射免疫法(RIA)測定采用競爭法，將緩沖液稀釋10倍，分別將125 ILN、抗LN血清、1

12、25 ICol、抗Col血清及二抗用緩沖液稀釋，將待測上清分別與125 ILN、125 ICol及相應(yīng)的抗血清混勻，4過夜反應(yīng)，加二抗4反應(yīng)60min，離心3500r/min 10min棄上清，125 I放射免疫測量儀計數(shù)。 6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均采用SDAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，結(jié)果用(±s)表示。 結(jié)果 腎康注射液與苯那普利對ECM成分含量的影響見表1。表1所示，在對ECM中FN含量影響方面，腎康注射液組(組)與空白對照組(組)相比，均有顯著性差異(P0.050.01)；說明腎康注射液除低濃度組2(組)外，其余各組對FN均有明顯的抑制作用，而且隨著濃度的遞增此作用更加明顯，并表現(xiàn)出一定的

13、量效關(guān)系。實驗還發(fā)現(xiàn)腎康注射液即使在極小濃度時對ECM中LN及Col 的含量也有明顯的抑制作用，該抑制作用也呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。從表1還可看出，苯那普利組(組)在對FN、Col 含量影響方面，與空白對照組相比也有顯著性差異(P0.010.05)；但對LN影響方面，兩者比較無顯著性差異(P0.05)；說明苯那普利對ECM中FN、Col 也有一定的抑制作用，但對LN其抑制作用不明顯。另外，從表中還可看出，腎康注射液各濃度組(組)與苯那普利組相比，在抑制LN方面也均有極顯著性差異(P0.01)；除腎康注射液低濃度組2(組)外，其余各組與苯那普利組相比，在抑制Col 方面也有顯著性差異(P0.010

14、.05)；腎康注射液高濃度組(組)與苯那普利組相比，在抑制FN方面也有顯著性差異(P0.05)；說明腎康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col 含量方面優(yōu)于苯那普利。 表1腎康注射液與苯那普利對ECM成分含量的影響(±s) 組別 n 藥物 FN(OD值) LN(ng/ml) Col (g/ml)  6 0.337±0.025 88.500±2.739 29.667±7.174  6 Benazepril 103mol/L 0.295±0.055* 83.667±6    .0

15、88 17.000±3.521*  6 SKI 100g/ml 0.252±0.030* 55.000±6.325* 6.667±1.033*  6 SKI 50g/ml 0.264±0.028* 56.833±6.047* 7.667±2.338*  6 SKI 25g/ml 0.271±0.031* 58.167±8.976* 8.833±3.125*  6 SKI 12.5g/ ml 0.280±0.021* 62.667±5.0

16、86* 9.333±3.933*  6 SKI 6.25g/ml 0.287±0.019* 72.000±3.688* 10.500±3.886*  6 SKI 3.125g/ml 0.333±0.012 74.667±1.966* 14.333±4.083*  注：與組比較，*P0.05，*P0.01；與組比較，P0.05，P0.01 討論 腎小球硬化時ECM的改變是近年來國內(nèi)外腎臟病學(xué)者研究的熱點之一，ECM在腎小球內(nèi)的蓄積，是腎小球硬化的主要特征性變化(2)。無論是免疫性或是非免疫性(如糖

17、尿病)損傷引起的腎小球硬化過程中，F(xiàn)N的變化早而明顯，隨后增多的是膠原，其中以、型為主(3，4)。因Col 約占腎小球基底膜干重的50%，且有人推測LN與Col 的合成是獨自進(jìn)行的再各自形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，然后相互產(chǎn)生作用(5)，故目前對腎小球硬化時ECM改變的研究主要集中在FN、LN及Col 的變化上。體外培養(yǎng)證實，腎小球的三種固有細(xì)胞(MC、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)均能產(chǎn)生ECM，其中以MC為最強(6)。腎小球MC屬于腎臟血管周固有細(xì)胞，在正常情況下，MC的數(shù)量、形態(tài)和位置保持相對穩(wěn)定，其合成基質(zhì)的能力也較小(7)。但在腎炎時常發(fā)生異?；顒樱斐蒃CM的大量產(chǎn)生與積聚(4)。所以如何減少系膜基質(zhì)的

18、擴張，降低ECM在腎小球內(nèi)的蓄積在防治腎小球硬化機制探討中占有十分重要的地位。 苯那普利是第四代血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)?，F(xiàn)已證實，腎臟具有獨立的腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，血管緊張素(Ang)是該系統(tǒng)最具有生物活性的因子。目前研究證實Ang受體(ATR)至少有和兩種亞型，其中型受體(ATR1)意義最大。該受體分布在腎小球MC上，與Ang、Ang有高度的親和力(8)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)ATR1占腎內(nèi)ATR亞型分布的90%以上，Osborne等在10余年前就報道動脈內(nèi)注射3H標(biāo)記的Ang，發(fā)現(xiàn)3H-Ang 只結(jié)合在腎小球系膜區(qū)，而不與腎血管、腎小管等部位結(jié)合。用125 I-Ang進(jìn)一

19、步實驗發(fā)現(xiàn)光鏡下125 I-Ang位于腎小球上，電鏡下125 I-Ang顆粒在MC漿中(9)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是RAS中最后一級酶促反應(yīng)的關(guān)鍵酶，用ACEI能夠抑制Ang的形成，可使循環(huán)和組織中的Ang水平下降，且可直接降低腎內(nèi)Ang的生成量，從而對抗Ang對腎臟的不良反應(yīng)，減輕腎小球硬化的發(fā)生。大量的研究還證實，ACEI除減輕腎小球的高灌注和高濾過作用外，還可通過阻斷腎小球基底膜(GBM)上Ang的特異作用的結(jié)合點，可使GBM固有的負(fù)電荷增多，并抑制GBM的進(jìn)一步增厚，從而直接改善GBM的通透性(8)。目前體內(nèi)外動物實驗還證實，ACEI亦有抑制腎小球MC和系膜基質(zhì)增生的作用，從而直接阻止腎小

20、球硬化的形成(10)。近年來，臨床上已成功地將ACEI用于各類腎臟病的治療，發(fā)現(xiàn)在降低蛋白尿，阻止腎小球硬化方面具有一定的作用。 本實驗結(jié)果表明，腎康注射液對ECM中FN、LN、Col 的含量具有明顯的降低作用，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。苯那普利雖對FN、Col 也有一定的抑制作用，但此抑制作用遠(yuǎn)不及腎康注射液明顯。從而提示MC是腎康注射液發(fā)揮治療作用的重要靶細(xì)胞，減輕ECM的積聚可能是腎康注射液延緩腎小球硬化的重要作用機制之一。值得注意的是，苯那普利主要是通過抑制Ang的形成，減輕其對腎臟的損害，從而在阻止腎小球硬化方面發(fā)揮著重要作用，而腎康注射液是否對Ang的形成也有一定的抑制作用，值得進(jìn)一步深入探討。 參考文獻(xiàn) 3，Nerlich A, Schleicher E. Immunohistochemical locolization of extracellural matrix components in human diabetic glomerular lesions. Am J Pathol1991；139(4)889891. 4，F(xiàn)loege