同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備

1、205生物工程食品科學(xué)2010, Vol. 31, No. 13同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備郭杰標(biāo)，許 楊*，劉師文(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047摘要：為了產(chǎn)生同時(shí)檢測(cè)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，本研究采用戊二醛法制備突出恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結(jié)構(gòu)的人工抗原。免疫Balb/c小鼠的結(jié)果顯示：使用糖基化載體所制備的免疫抗原，能夠大幅提高所產(chǎn)生特異性抗體的滴度。通過細(xì)胞融合，篩選出一株對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC 50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體。關(guān)鍵詞：恩諾沙星；環(huán)丙沙星；糖基化載體；獸藥殘留；人工抗原；免疫

2、效果Preparation of Monoclonal Antibody for Simultaneous Detection of Enrofloxacin and CiprofloxacinGUO Jie-biao，XU Yang*，LIU Shi-wen(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University, Nanchang 330047, ChinaAbstract ：In order to generate a mon

3、oclonal antibody with specificity to simultaneously detect enrofloxacin and ciprofloxacin,glutaraldehyde was used to prepare the artificial antigens with common structures of enrofloxacin and ciprofloxacinexposed as the major epitopes. Balb/c mice were immunized with the prepared immunogens. Results

4、 indicated thatglycosylated BSA used for immunogen synthesis resulted in a higher antiserum titer when compared to unglycosylatedBSA. A monoclonal antibody with respective IC50 values of 9.6 ng/mL and 10.2 ng/mL to enrofloxacin and ciprofloxacinwas successfully prepared through cell fusion.Key words

5、：enrofloxacin ；ciprofloxacin ；glycosylated carrier；veterinary drug residues；artificial antigen；immunological effect中圖分類號(hào)：R392.11；R446.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002-6630(201013-0205-04收稿日期：2009-12-14基金項(xiàng)目：江西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2007BS12501氟喹諾酮是一類強(qiáng)效、廣譜的合成抗菌素，通過抑制細(xì)菌DNA 解旋酶發(fā)揮抗菌效力1。這類藥物在畜牧、水產(chǎn)業(yè)被廣泛應(yīng)用治療和預(yù)防細(xì)菌感染，并作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物的

6、生長(zhǎng)2。恩諾沙星是獸藥領(lǐng)域最常用的氟喹諾酮藥物，我國(guó)制定了在食品中恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的總殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRLs，以避免這兩種藥物在食品中的殘留所造成的細(xì)菌耐藥性和過敏反應(yīng)等健康危害。目前，檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的主要微生物法1和儀器學(xué)方法，包括液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜3-6，毛細(xì)管電泳7等。微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng)，而儀器學(xué)方法需要昂貴的設(shè)備且運(yùn)行費(fèi)用高，難以在基層檢測(cè)部門廣泛推廣。檢測(cè)一種氟喹諾酮藥物8-10和檢測(cè)氟喹諾酮藥物總量11-13的免疫學(xué)方法已有報(bào)道，但是同時(shí)檢測(cè)食品中恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量的免疫學(xué)法還有待開發(fā)。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式見圖1，本研究采用

7、環(huán)丙沙星作為代表半抗原制備人工抗原，并將其免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供條件。圖1恩諾沙星和環(huán)丙沙星的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of enrofloxacin and ciprofloxacinF OCOOHC 2H 5F OCOOHH 恩諾沙星環(huán)丙沙星2010, Vol. 31, No. 13食品科學(xué)生物工程2061材料與方法1.1材料、試劑與儀器恩諾沙星和環(huán)丙沙星 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；弗氏完全(不完全 佐劑、戊二醛、葡萄糖、乳糖、牛血清白蛋白(BSA、卵清白蛋白(OVA 上海生工生物

8、工程技術(shù)服務(wù)有限公司；山羊抗鼠IgG-HRP 酶標(biāo)二抗 GeneTex 公司；96孔酶標(biāo)板 Costar公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Ultrospec 紫外-可見光掃描儀 美國(guó)安瑪西亞公司；Multiskan MCC/340酶標(biāo)儀 Labsystems公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠(雌性，4周齡 購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批準(zhǔn)號(hào)為：贛(動(dòng)96-021 。1.3方法 環(huán)丙沙星免疫抗原的制備環(huán)丙沙星檢測(cè)抗原的制備環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比例的計(jì)算環(huán)丙沙星區(qū)別于載體蛋白的特征吸收波長(zhǎng)為340nm ，在該波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)K =4.5mL/mg，人工抗原蛋白濃度的測(cè)定使用雙縮脲法15。(O

9、D340nm /K /環(huán)丙沙星摩爾質(zhì)量環(huán)丙沙星人工抗原偶聯(lián)比= 載體蛋白質(zhì)量濃度/蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量小鼠免疫取4周齡的雌性Balb/c小鼠，以100g/只的抗原劑量，加完全佐劑充分乳化后，皮下多點(diǎn)初次免疫。28d 后，以不完全佐劑乳化抗原以加強(qiáng)免疫。之后每21d ，以同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。對(duì)照組采用非糖基化載體制備的免疫抗原進(jìn)行免疫?？贵w效價(jià)檢測(cè)單克隆抗體篩選與鑒定參照Guo 等16的方法，篩選得到分泌抗環(huán)丙沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 對(duì)所獲得抗體的特性進(jìn)行鑒定。2結(jié)果與分析2.1人工抗原的合成環(huán)丙沙星人工抗原的制備原理見圖2。戊二醛是雙功能試劑，通過和蛋白質(zhì)上的氨基和環(huán)

10、丙沙星哌嗪環(huán)上的亞氨基反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)環(huán)丙沙星和載體蛋白之間連接，使恩諾沙星和環(huán)丙沙星的共同結(jié)構(gòu)暴露在人工抗原的外部，成為主要的抗原位點(diǎn)。圖3載體蛋白、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星免疫抗原溶液的紫外掃描圖譜Fig.3 UV absorption spectra of glycosylated BSA, ciprofloxacin andciprofloxacin immunogenO D 340n m波長(zhǎng)/nm200240280320360環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星免疫抗原圖2人工抗原的合成Fig.2 Synthesis route of artificial antigenHOH HFOCOOH207生物工程食品

11、科學(xué)2010, Vol. 31, No. 13戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。圖4是分別以糖基化載體和天然載體制備的環(huán)丙沙星抗原免疫的SDS PAGE圖譜。泳道3顯示，使用天然B SA 制備的免疫抗原，在戊二醛作用下造成了載體蛋白蛋白的聚集。 葡萄糖、乳糖是還原糖，分子結(jié)構(gòu)中含有醛基，在偏堿性條件葡萄糖和乳糖會(huì)與BSA 上的氨基縮合，把蛋白上的氨基封閉。泳道4顯示，經(jīng)過糖基化BSA 分子質(zhì)量比天然BSA(泳道2 增大。泳道5顯示，以糖基化BSA 為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原，由戊二醛導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象得到了避免。由此可見，使用糖基化載體制備環(huán)丙沙星免疫抗原，由

12、于載體蛋白上的氨基數(shù)量減少，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量。2.2免疫小鼠效果為載體制備的環(huán)丙沙星免疫抗原作對(duì)照，評(píng)價(jià)3種糖基化環(huán)丙沙星抗原免疫小鼠的效果。4種抗原免疫小鼠后抗體效價(jià)的上升曲線見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用糖基化BSA 為載體制備的3種免疫抗原，比對(duì)照抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗環(huán)丙沙星特異性抗體的能力要強(qiáng)很多。2.3單克隆抗體的篩選與鑒定本實(shí)驗(yàn)使用免疫效果最好的糖基化免疫抗原，在第4次免疫之后獲得了較高的抗體效價(jià)。通過細(xì)胞融合，順利獲得了檢測(cè)環(huán)丙沙星及其代謝前體恩諾沙星的單克隆抗體(1G3。經(jīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 進(jìn)行鑒定，該抗體對(duì)這兩種藥品的IC 50值分別為9.6

13、ng/mL和10.2ng/mL，靈敏度和特異性能夠滿足同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品在食品中的殘留的需要。3討論環(huán)丙沙星是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)后才可以免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。經(jīng)過分析和比較，發(fā)現(xiàn)把環(huán)丙沙星分子中哌嗪環(huán)上的亞氨基作為連接位點(diǎn)制備的人工抗原，有利于獲得針對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星共同結(jié)構(gòu)的抗體。有文獻(xiàn)報(bào)道，制備人工抗原的連接臂的最適長(zhǎng)度在36個(gè)碳原子，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長(zhǎng)又會(huì)造成折疊導(dǎo)致半抗原分子被載體蛋白掩蓋不利于產(chǎn)生抗體17，戊二醛作為連接手臂正好符合36個(gè)碳原子的條件。戊二醛在堿性條件下可以與氨基或亞氨基縮合，能夠把環(huán)丙沙星上的亞氨基連接到蛋白載體上

14、。戊二醛是很活潑的連接劑，很容易與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)造成蛋白質(zhì)聚集。使用糖基化載體制備免疫抗原，能夠避免載體蛋白的聚集，同時(shí)增加環(huán)丙沙星免疫抗原的分子質(zhì)量和免疫原性。通過免疫動(dòng)物和細(xì)胞融合，篩選出了一株對(duì)恩諾沙星和環(huán)丙沙星IC 50值分別為9.6ng/mL和10.2ng/mL的單克隆抗體，為建立同時(shí)檢測(cè)這兩種藥品總殘留量的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法提供了條件。參考文獻(xiàn)：1ASHWIN H, STEAD S, CALDOW M, et al. A rapid microbial inhibition-based screening strategy for uoroquinolone and quinol

15、oneresidues in foods of animal originJ. Anal Chim Acta, 2009, 637(1:241-246.2Determination of dano oxacin in milk combining second-order calibra-tion and standard addition method using excitation-emission fluores-cence dataJ. Food Chem, 2009, 113(4: 1260-1265.3CINQUINA A L, ROBERTI P, GIANNETTI L, e

16、t al. Determination ofenrofloxacin and its metabolite ciprofloxacin in goat milk by high-泳道1.Marker ；泳道2.BSA ；泳道3. 環(huán)丙沙星-BSA 免疫抗原；泳道4. 糖基化BSA ；泳道5. 環(huán)丙沙星-糖基化BSA 免疫抗原。圖4天然BSA 和糖基化BSA 制備的環(huán)丙沙星免疫抗原SDS PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE patterns of ciprofloxacin immunogens prepared withnative BSA and glycosylated BSA97.

17、2kD 1234566.7kD圖5糖基化載體和天然載體制備的抗原免疫小鼠的效果比較Fig.5 Comparison of antiserum titer induced by ciprofloxacinimmunogens prepared with native BSA and glycosylated BSA糖基化載體 偶聯(lián)比6.3:1糖基化載體 偶聯(lián)比7.2:1糖基化載體 偶聯(lián)比8.3:1非糖基化載體 偶聯(lián)比9.1:1抗體效價(jià)(×103二次免疫三次免疫四次免疫2010, Vol. 31, No. 13食品科學(xué)生物工程208performance liquid chromatog

18、raphy with diode-array detection optimiza-tion and validationJ. J Chromatogr A, 2003, 987(1: 221-226.4KREBBER R, HOFFEND F J, RUTTMANN F. Simple and rapiddetermination of enrofloxacin and ciprofoxacin in edible tissues byturbulent flow chromatography-tandem mass spectrometry (TFC-MS/MSJ. Anal Chim A

19、cta, 2009, 637(1: 208-213.5graphic method, with fluorometric detection, for the determination ofenrofloxacin and ciprofloxacin in plasma and endometrial tissue of maresJ. Anal Chim Acta, 2006, 560(1: 227-234.6IDOWU O R, PEGGINS J O. Simple, rapid determination of enro-floxacin and ciprofloxacin in b

20、ovine milk and plasma by high-perfor-mance liquid chromatography with fluorescence detectionJ. J PharmBiomed Anal, 2004, 35(1: 143-153.7ZHOU Xiaoming, XING Da, ZHU Debin, et al. Development andapplication of a capillary electrophoresis-electrochemiluminescent method for the analysis of enrofoxacin a

21、nd its metabolite cipro floxacin in milkJ. Talanta, 2008, 75(5: 1300-1306.8LU Shengxin, ZHANG Yulan, LIU Jingting, et al. Preparation of anti-pefloxacin antibody and development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of pefloxacin residue in chickenliverJ. J Agric

22、 Food Chem, 2006, 54(16: 6995-7000.9ZHAO Chenbiao, LIU Wei, LING Hongli, et al. Preparation ofanti-gatifloxacin antibody and development of an indirect com-petitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection ofgatifloxacin residue in milkJ. J Agric and Food Chem, 2006, 55(15: 6879-6884.10SH

23、ENG Wei, XIA Xunfeng, WEI Keyi, et al. Determination of marbofloxacin residues in beef and pork with an enzyme-linkedimmunosorbent assayJ. J Agric Food Chem, 2009, 57(13: 5971-5975.11BUCKNALL S, SILVERLIGHT J, COLDHAM N, et al. Antibody tothe quinolones and fluoroquinolones for the development of ge

24、neric andspecific immunoassays for detection of these residues in animal productsJ. Food Addit & Contam, 2003, 20(1: 221-228.12HUET A C, CHARLIER C, TITTLEMIER S A, et al. Simutaneousdetermination of (fuloroquinolone antibiotics in kidney, marine products,eggs, and muscle by enzyme-linked Immunosorbent assayJ. J Agricand Food Chem, 2006, 54(3: 2822-2827.13WANG Zhanhui,