大腸癌噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗CEA抗體的篩選

1、作者：南清振，高蕾，張振書，楊希山，肖冰，姜泊 【摘要】目的 構(gòu)建及初步鑒定大腸癌噬菌體抗體Fab呈現(xiàn)庫(kù)，篩選人CEA單克隆抗體，并進(jìn)行序列分析。方法 分離大腸癌患者外周血淋巴細(xì)胞，提取淋巴細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用PCR擴(kuò)增人全套抗體基因片段，克隆于pComb3載體，再經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1Blue菌株，形成噬菌體抗體庫(kù)。以固相化CEA抗原淘篩抗體庫(kù)，ELISA鑒定噬菌體抗體。其中一個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果 逆轉(zhuǎn)錄PCR分別擴(kuò)增出約680bp大小的、和Fd基因。PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)純化、雙酶切后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，成功地構(gòu)建了人源性Fab抗體基因庫(kù)，庫(kù)容量達(dá)2.1107，F(xiàn)ab基因重組率

2、為50%。以單抗捕獲的CEA抗原淘洗4輪，出現(xiàn)特異性富集，陽(yáng)性克隆經(jīng)直接ELISA和交叉反應(yīng)ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有良好的抗CEA抗原特異性。DNA測(cè)序表明該抗體重鏈屬IgG亞類并含有一條IgL亞類的輕鏈。結(jié)論 成功構(gòu)建了大腸癌患者自然致敏抗體Fab段噬菌體呈現(xiàn)庫(kù)，從中獲得可與CEA抗原結(jié)合的噬菌體抗體，由此為大腸癌早期診斷及基因治療提供了一種新的思路和方法。 【關(guān)鍵詞】大腸腫瘤；噬菌體抗體庫(kù)；Fab抗體；癌胚抗原Abstract： ObjectiveTo construct the Fab phage display antibody library of colorectal cancer

3、so as to screen carcinoembryonic antigen (CEA) phage antibody from the constructed phage display library.MethodsThe total cell RNA was extracted from a colorectal cancer patients peripheral lymphocytes, and reversetranscribed into cDNA. These cDNA were amplified to the light and the heavy chain DNA

4、by PCR using relevant primers, and then cloned into the expression pComb3 vector. Through transformed into XL1Blue Escherichia coli by electroporation, the phage display antibody library was constructed successively. After that, CEA antigen was coated to pan the constructed library in order to selec

5、t antigen binders, and the selected phage antibodies were assayed by ELISA analysis. One positive clone was analyzed by DNA sequenced. ResultsThe amplified fragments of , and Fd DNA were about 680bp. The amplification products were cloned into the expression pComb3 vector and were expressed in XL1Bl

6、ue Escherichia coli. A human Fab antibody library was constructed with a size of 2.1107 and an efficacy of about 50% (, and Fd DNA were all inserted). Using coated CEA antigen to pan the phage display antibody library four rounds, the phage antibodies showed enrichment specifically. The positive clo

7、nes had good antiCEA specificity which verified by ELISA directly and crossreaction. Through DNA sequencing of one positive clone, it showed that its heavy chain belonged to IgG subvariety and its light chain to IgL subvariety. ConclusionWe succeed in constructing a Fab phage display antibodies libr

8、ary with natural immunity by a colorectal cancer patient. From it, we also succeed in obtaining the antibody which has the binding activity to CEA antigen.Keywords： colorectal cancer; phage antibody library; Fab antibody; carcinoembryonic antigen噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)將抗體輕鏈基因和重鏈基因在體外重組并借助噬菌體表面展示 （phage display）系統(tǒng)對(duì)

9、目的抗體基因進(jìn)行篩選1。 該技術(shù)能夠繞開細(xì)胞雜交瘤技術(shù)， 直接從基因水平制備特異性單鏈抗體，由此開創(chuàng)了簡(jiǎn)便、快速生產(chǎn)基因工程抗體的先河，這被認(rèn)為是繼雜交瘤技術(shù)后抗體生產(chǎn)技術(shù)的又一次革命。自該技術(shù)的問世，已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域。 我們采用噬菌體顯示技術(shù)構(gòu)建了人大腸癌自然致敏抗體Fab段噬菌體呈現(xiàn)庫(kù)，以人CEA作為目標(biāo)抗原，制備了人源性的抗CEA單克隆抗體。1材料和方法1.1材料1.1.1噬粒、菌株、細(xì)胞及主要試劑表達(dá)噬粒載體pComb3、大腸埃希菌菌株XL1Blue和輔助噬菌體VCSM 13為本研究室保存。淋巴細(xì)胞分離液(天津血液研究所) ，總RNA提取試劑盒(invitrogen產(chǎn)品)

10、， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)、Taq酶及PCR緩沖液(TaKaRa公司產(chǎn)品)，DNA凝膠純化回收試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)，各種限制性內(nèi)切酶（Promega產(chǎn)品）。羊抗人IgG（Fab）HRP購(gòu)自Pierce公司，鄰苯二胺（OPD）購(gòu)自博士德公司。LB、SB、SOC培養(yǎng)基配置參照文獻(xiàn)1。1.1.2PCR引物引物設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn)2。由上海生物工程有限公司合成。序列如下：Human variable and constant region PCR primers used for phage library constructionHuman chain variable region

11、5primers：VH1a 5CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GG3VH1f 5CAG GTG CAG CTG CTC GAGTCT GGG3VH2f 5CAG GTG CAG CTA CTC GAGTCG GG3VH3a 5GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG3VH3f 5GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG3VH4f 5CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG3VH4gs 5CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GGC3VH6a 5CAG GTA CAG CTC GAG CAG

12、 TCA GG3VH6f 5CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GGT CCA3Heavy chain1 constant region 3 primer：CGlz 5GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG3 light chain variable region 5 primes:VK1a 5GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA3VK1s 5GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC3VK2a 5GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA3VK3a 5GAA ATT G

13、AG CTC ACG CAG TCT CCA3VK3b 5GAA ATT GAG CTC ACA CAG TCT CCA3 light chain constant region 3 prime：CK1d 5GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT GA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G3 light chain variable region 5 primers：VL1 5AAT TTT GAG CTCACT CAG CCC CAC3VL2 5TCT GCC GAG CTCCAG CCT GCC TCC GTG3VL3

14、5TCT GTG GAG CTCCAG CCG CCC TCA GTG3VL3 5TCC TAT GAG CTCACT CAG CCA CCC3VL4 5TCT GAA GAG CTCCAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG3VL5 5CAG TCT GAG CTCACG CAG CCG CCC3VL6 5CAG ACT GAG CTCACT CAG GAG CCC3VL7 5CAG GTT GAG CTCACT CAA CCG CCC3VL8 5CAG GCT GAG CTCACT CAG CCG TCT TCC3VL9 5CAG TAT GAG CTCACT CAG CCT

15、CCC3VL1b/s 5CAG TCT GAG CTC ACT CAG CCA CC3 light chain constant region 3 primers：CL2 5CG CCG TCT AGA ATT ATG AAC ATT CTG TAG G3Underline nucleotides represent primerencoded restriction sits.CTC GAG 內(nèi)切酶Xho I識(shí)別位點(diǎn)； ACT AGT 內(nèi)切酶Spe I識(shí)別位點(diǎn) ；GAG CTC 內(nèi)切酶Sac I識(shí)別位點(diǎn)； TCT AGA 內(nèi)切酶Xba I識(shí)別位點(diǎn)。1.2方法1.2.1標(biāo)本制備、總RNA提取和

16、cDNA的合成抽取大腸癌患者的外周血20 ml，用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離PBMC，然后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA的提取，檢測(cè)其完整性和純度。1.2.2逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。反應(yīng)體積為25 l，取淋巴細(xì)胞總RNA 4 g，加入0.5 g Oligo(dt)，40 U RNA酶抑制劑，250 mol/L dNTPs，40 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。于42 60 min，95 5min，合成單鏈cDNA。然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積各為100 l。取上述合成的單鏈cDNA 2 l 分別加入與、輕鏈和重鏈Fd段分別配對(duì)的引物各50 pmol/L，dNTPs 200 mol/L，10Taq酶緩沖液1

17、0 l，Taq酶5 U。循環(huán)參數(shù)為93 45 s， 52 60 s，72 90 s，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物各行1%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化回收。1.2.3輕鏈表達(dá)載體的構(gòu)建純化的、輕鏈PCR產(chǎn)物與pComb3分別以適量Xba I及Sac I雙酶切后仍經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化回收。回收的PCR產(chǎn)物等量混均后與線性pComb3連接，連接反應(yīng)體系中線性pComb3與輕鏈PCR產(chǎn)物的mol比為1：3，T4 DNA連接酶9 U，總體積50 l，16 反應(yīng)15 h。連接反應(yīng)產(chǎn)物以Promega DNA純化試劑盒純化。電穿孔(25 kv，200，25 F)轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1 Blue后置5ml SO

18、C培養(yǎng)液中。37 下振蕩培養(yǎng)(250 rpm)1 h，加入預(yù)溫的SB 10 ml(含20 ml/L Amp和10 mg/L Tet)，混勻后即取出10、1、0.1 l 鋪在LB平板(含50 mg/L Amp及10 mg/L Tet)上，37 過夜，測(cè)定轉(zhuǎn)化率。余繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1 h 后調(diào)Amp濃度至50 mg/L，再振蕩培養(yǎng)1 h，并入100 ml SB(含50 mg/L Amp、10 mg/L Tet)，37 振蕩培養(yǎng)(250 rpm)。從過夜培育的細(xì)菌中提取質(zhì)粒，即得帶輕鏈插段的pComb3， 即輕鏈表達(dá)載體。1.2.4抗體Fab段表達(dá)載體的構(gòu)建（噬菌體抗體呈現(xiàn)庫(kù)的構(gòu)建）及酶切鑒定將PCR擴(kuò)

19、增的重鏈Fd段基因和輕鏈重組質(zhì)粒分別以XhoI/SpeI雙酶切，按前法進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、細(xì)菌擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化子測(cè)定。但在加入100 ml SB振蕩3 h 后， 加入1012pfu的輔助噬菌體VCSM 13，再培養(yǎng)2 h 后，加卡那霉素至70 mg/L， 37 振蕩過夜。次晨4 ，4 000g離心15 min，向上清中加入固體聚乙二醇(PEG8000)及NaCl，兩者終濃度分別為40和30 g/L，溶解后冰浴30 min， 4 ，9 000g離心20min棄上清，以2 ml 10 g/L 牛血清白蛋白Tris緩沖液(BSA TBS)懸浮噬菌體沉淀， 14 000g離心5 min 以除去殘留細(xì)菌碎片。上清

20、加疊氮鈉(NaN3)至0.2 g/L，即得Fab噬菌體呈現(xiàn)原始庫(kù)。隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，分別用XhoI/SpeI及Sac I/Xba I進(jìn)行雙酶切，鑒定其重組率。1.2.5噬菌體抗體的篩選（參照文獻(xiàn)3）將CEA抗原用0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至50 mg/L，按每孔100 l 包被酶聯(lián)板，4 過夜；然后用3%BSA封閉，37 反應(yīng)1 h 。加入100 l 噬菌體抗體庫(kù)(約1012 cfu)，37 反應(yīng)2 h。用TBST（50 mmol/LTrisHCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.5%Tween20）洗滌10次，用蒸餾水沖洗1

21、 min。加入100 l洗脫液(0.1 mol/L HCl，用甘氨酸調(diào)pH值至2.2，加入BSA至0.1%)，吹打后室溫靜置10 min。加入6 l 2 mol/L 的Tris中和。然后將其轉(zhuǎn)入2 ml 新鮮培養(yǎng)的XL1 Blue(A6001)室溫靜置15 min，取出10、1、0.1 l 鋪在LB平板(含50 mg/L Amp及10 mg/L Tet)上，37 過夜，測(cè)定轉(zhuǎn)化率。余全部轉(zhuǎn)入10 ml SB培養(yǎng)基(含20 ml/L Amp和10 mg/L Tet)中，37 培養(yǎng)1 h。然后轉(zhuǎn)入100 ml SB培養(yǎng)基(含50 ml/L Amp和10 mg/L Tet)中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再加入100 l 的輔助噬菌體VCSM13(約1012pfu)，37 培養(yǎng)2 h。加入卡那霉素至70 mg/L，37 振蕩培養(yǎng)過夜。次晨4 ，4 000g離心15 min，收集上清，加入聚乙二醇(PEG8000) 和NaCl分別至4%和3%，溶解后冰浴30