大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)法

1、大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)法 胰島散在于胰外分泌組織中呈島狀，是由數(shù)千個細(xì)胞組成的小器官。惟獨分別、收集胰島才有可能解析其固有功能。胰島從外分泌腺組織中分別稱胰島單離，盡管已建立了多種辦法，但獲得較高純度的胰島細(xì)胞仍較困難。胰島細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用極為廣泛，如胰島細(xì)胞代謝、細(xì)胞分泌激素及激素合成機制的解析，細(xì)胞表面抗原，細(xì)胞受體及細(xì)胞帶電現(xiàn)象的討論，胰島腫瘤化及對其有害藥物的討論，以及胰島移植的應(yīng)用等。 【材料】 1胰島單離法 (1）組織來源：大鼠（250g左右）12只。 (2)試劑：hanks液；膠原酶, i型或v型）；或。 (3）器具：各種吸管，試管（吸管與試管最好硅化處理），35 mm塑料培養(yǎng)皿，玻璃蒸

2、發(fā)皿（約50 mm左右）。解剖器具一套，20m1注射器，針頭接4號靜脈導(dǎo)管或2123g翼狀頭皮針頭，彌漫hanks液。恒溫振蕩器（180200r/min )。 2.胰島收集法 (1)膠原酶消化后的胰組織。 (2) ficoll-conray液：如表4-2制備450ml a液，然后應(yīng)按adcb挨次，分離制備b,c,d液。 a液：fico11400終濃度8.3%,conray400（碘他拉酸鈉sodium iotalamate 66.8%溶液）終濃度11.1%，加lmg/ml，50ug/ml,0.002等制成水溶液，高壓滅菌后用nahc03調(diào)節(jié)至ph 7.4,a液比重為1.095，滲透壓396mo

3、sm/l。 b液：在c液中加入等量的a液 c液：在d液中加入等量a液 d液：在a液中加等量滅菌蒸餾水 （3）hanks液 (4）各種吸管、試管、離心管（最好硅化） (5）渦旋混勻器 3.胰島細(xì)胞簇?fù)矸?(1）單離胰島細(xì)胞100500個。 (2）培養(yǎng)基：mem,dmem或rpmi 1640+510（fbs)。 (3）消化液：中性蛋白酶(dispase,1000u/ml),0.020.04% edta/cmf液，無鈣鎂hanks液（cmf-hanks液）。 (4）器具：各種吸管，15 ml離心管，磁心棒（徑15mm),10ml三角燒瓶（底面平坦便于磁心棒旋轉(zhuǎn)，放入磁棒后高壓滅菌），35 mm塑料培

4、養(yǎng)皿或24孔，96孔微量培養(yǎng)板，細(xì)胞計數(shù)器一套，恒溫磁力攪拌器。 【辦法】 1胰島單離法 （1)摘取胰腺： 1)鼠在或戊巴比妥麻醉下固定四肢，開腹，找到肝、脾、胃和十二指腸等臟器的位置，切斷肝葉間隙薄膜，反轉(zhuǎn)至頭側(cè)，裸露膽總管的走行，在膽總管的末梢十二指腸開口處近肝側(cè)留一把無鉤鉗，在有副胰管的狀況下也留一把鉗（圖4-6)。 2）從肝管分支部向十二指腸側(cè)周圍組織中分別膽總管，繞一結(jié)扎線，于此部用剪刀剪開膽總管一小口，立刻見黃色膽汁逆流溢出，從今口插入靜脈導(dǎo)管的注射器，行向十二指腸并結(jié)扎固定（用翼狀頭皮針時可不剪開小口）。徐徐注入hanks液約20m1，液體經(jīng)膽總管逆流至胰管內(nèi)，使其膨脹至胰尾，用

5、鑷子純性剝離膨脹的胰腺并摘取下來，去除附著的脂肪組織與淋巴結(jié)等。 (2）消化胰腺：將膨脹的胰腺移至蒸發(fā)皿內(nèi)，用眼科剪剪碎至lmm以下，倒入hanks液，組織片沉下，去除飄蕩的脂肪和膜等組織，移至試管內(nèi)盡量吸掉hanks液，留細(xì)切胰組織容量約為1 ml時，加入5 mg膠原酶粉，嚴(yán)密封蓋后將試管置37恒溫水浴振搖器上，沿著試管長軸水平振蕩180200次分鐘，約810分鐘，取出試管振搖56秒，見組織片細(xì)薄均等，并附著于管壁，或在管壁上有約0.5 mm大小透亮斑點附著，此狀表示消化終了。 (3）收集消化細(xì)胞：于消化終了的胰腺組織試管中加入適量hanks液，1200r/min離心1分鐘，去上清液，如此再

6、洗滌一次，如在沉渣中見有黏蛋白樣物質(zhì)，則用毛細(xì)吸管吸掉。 2胰島收集法（圖4-7) (1）于上法得到的沉渣中加a液（ficoll-conray) 3 ml,在渦旋混勻器上混合后，再用1 ml a液洗落附在管壁上的組織片，吹吸混勻，靜置后沿管壁漸漸分層加入b,c,d液各2ml,3000r/min，離心10分鐘，如徹低單離時，胰島將集中在c-d界面上。 (2）用毛細(xì)滴管從c-d界面取出胰島集中于離心管中，加hanks液吹吸混勻后，1200r/min離心1分鐘，反復(fù)洗滌2次，最后用培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。 3.胰島細(xì)胞簇?fù)矸?(1)單離的胰島用毛細(xì)管移至離心管內(nèi)，1200r/min離心23分鐘，去上清。加入

7、edta液5 ml，室溫置5分鐘，并間隔振搖，再次離心，去上清液；加入dispase液1 ml混勻，靜置，待胰島沉淀，用毛細(xì)管吸上清液移至一個帶磁心棒的三角燒瓶內(nèi)，同樣操作反復(fù)加dispase液，總量用盡4ml，注重在移加時不要走失胰島。將三角燒瓶放磁力攪拌器上，37，80100r/min攪拌15分鐘（圖4-8）。 (2)用毛細(xì)管輕輕吹打數(shù)次使其簇?fù)恚瑢⑷菬啃敝?，?dāng)未消化的胰島下沉?xí)r，吸出上清液約3 ml收集于離心管中再補加23 ml培養(yǎng)基。在三角燒瓶中加dispase液3 ml,進(jìn)一步消化巧分鐘，同樣收集上清單個細(xì)胞，共消化3次可使單離胰島徹低簇?fù)?。離心洗掉dispase液以停止消化。集中的單個細(xì)胞最后用1200r/m