轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述摘要：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)作為一種新的高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組 研究手段正在改變著人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)。 RNA-Seq 利用高通量測(cè) 序技術(shù)對(duì)組織或細(xì)胞中所有 RNA 反轉(zhuǎn)錄而成 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序， 通過(guò)統(tǒng)計(jì)相關(guān)讀段(reads數(shù)計(jì)算出不同RNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn) 錄本；如果有基因組參考序列，可以把轉(zhuǎn)錄本映射回基因組，確定轉(zhuǎn) 錄本位置、 剪切情況等更為全面的遺傳信息， 已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研 究、醫(yī)學(xué)研究、 臨床研究和藥物研發(fā)等。文章主要比較近年來(lái)轉(zhuǎn)錄組 研究的幾種方法和幾種 RNA-Seq的研究平臺(tái)，著重介紹RNA-Seq的 原理、用途、步驟和生物信息學(xué)

2、分析，并就 RNA-Seq 技術(shù)面臨的挑 戰(zhàn)和未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了討論及在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用等內(nèi)容， 為今后該 技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。關(guān)鍵詞：RNA-Seq;原理應(yīng)用；方法；挑戰(zhàn)；發(fā)展前景Abstract ： Transcriptome sequencing (RNA-Seq) is a kind of high efficiency, quick transcriptome research methods are changing our understanding of transcriptome. RNA-Seq to use high-throughput sequencing of

3、tissues or cells of all RNA reverse transcription into cDNA library were sequenced,through statistical correlation read paragraph (reads) numbers were calculated from the expression of different RNA transcripts, find new; if the genome reference sequence,the transcripts mapped to genomic, determine

4、the position of the transcription shear condition, more genetic information, has been widely used in biological research, medical research, clinical research and drug development. This paper compared several methods of platform transcriptome studies and several kinds of RNA-Seq in recent years, RNA-

5、Seq focuses on the principle, purpose, steps and bioinformatics analysis, and discussesthe RNA-Seq technology challenges and future development prospect and the application in related field and other content, provide the reference for the research and application of the technology future.Key word ：

6、RNA-Seq ;application; principle; method; challenge; development prospects前言： 轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄 出來(lái)的所有 RNA 的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能 以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過(guò)程以及疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)理。 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行 cDNA 測(cè)序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎 所有轉(zhuǎn)錄本。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代 謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn)， 其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來(lái)以及 應(yīng)

7、用最廣泛的技術(shù) 1。遺傳學(xué)中心法則表明， 遺傳信息在精密的調(diào)控 下通過(guò)信使 RNA(mRNA) 從 DNA 傳遞到蛋白質(zhì)。因此， mRNA 被認(rèn) 為是 DNA 與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個(gè) “橋梁 ”，而所有表達(dá)基 因的身份以及其轉(zhuǎn)錄水平，綜合起來(lái)被稱作轉(zhuǎn)錄組 (Transcriptome)2 。 轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的 所有RNA的總和，主要包括 mRNA和非編碼RNA(non-coding RNA , ncRNA)2, 3。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn) , 了 解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細(xì)胞及組織中分子組成所必 需的，并且對(duì)理解

8、機(jī)體發(fā)育和疾病具有重要作用。 整個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析的 主要目標(biāo)是：對(duì)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如 其起始位點(diǎn)，5 和 3末端，剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾；并量化各轉(zhuǎn) 錄本在發(fā)育過(guò)程中和不同條件下 (如生理 /病理)表達(dá)水平的變化 2,3 。 在過(guò)去的十幾年里， 雜交技術(shù)的發(fā)展， 再加上以標(biāo)簽序列為基礎(chǔ)的方 法的應(yīng)用， 第一次使研究人員對(duì)這一領(lǐng)域有了深入的了解， 但毋庸置 疑，隨著新一代測(cè)序(Next-generation sequencing NGS)平臺(tái)的市場(chǎng)化， RNA-Seq(RNA sequencing技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)徹底改變了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的思 維方式。RNA-Seq,即RNA測(cè)序

9、又稱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，是最近發(fā)展起來(lái) 的利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù) 3，該技術(shù)能夠在單核苷 酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)， 在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和 表達(dá)水平的同時(shí)， 還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本， 精確地識(shí)別可 變剪切位點(diǎn)以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)，提供更為全面的 轉(zhuǎn)錄組信息。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)， RNA-Seq 無(wú)需預(yù)先針對(duì) 已知序列設(shè)計(jì)探針， 即可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)， 提供 更精確的數(shù)字化信號(hào)， 更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍， 是目 前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具， 已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、 醫(yī) 學(xué)研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。本文在扼要

10、介紹支持 RNA-Seq 的 新一代測(cè)序平臺(tái)的基礎(chǔ)上，對(duì) RNA-Seq 原理、特點(diǎn)以及到目前為止 在研究真核生物轉(zhuǎn)錄特征方面的進(jìn)展做一個(gè)較為全面的綜述， 并對(duì)其 中有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題進(jìn)行了展望。1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基本原理及平臺(tái) 4隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)， 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為率先發(fā)展且應(yīng)用相對(duì) 廣泛的技術(shù) 5 。最早廣泛應(yīng)用測(cè)序技術(shù)為 70 年代的 Sanger 法，這 也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)，因其測(cè)序通量低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，科學(xué) 家們一直在尋求通量更高、速度更快、價(jià)格更便宜、自動(dòng)化程度更高 的測(cè)序技術(shù)。自2005年以來(lái)，以Roche公司的454技術(shù)、lllumina 公司的 Solexa 技術(shù)以及

11、 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的高通量 測(cè)序技術(shù)相繼誕生 6 。相較于傳統(tǒng)方法，該技術(shù)主要特點(diǎn)是測(cè)序通 量高、測(cè)序時(shí)間和成本顯著下降， 可以一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條 DNA 分子序列測(cè)定， 這使某物種全基因組和轉(zhuǎn)錄組的全貌細(xì)致分析成為可 能，又稱為深度測(cè)序，很多文獻(xiàn)中稱其為新一代測(cè)序技術(shù)，足見(jiàn)其劃 時(shí)代意義 7。利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行對(duì)某物種轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)即 RNA測(cè)序（RNA-Seq），該項(xiàng)技術(shù)能夠在單核苷酸水平對(duì)任意生物種 的整體轉(zhuǎn)錄進(jìn)程檢測(cè)， 不僅可以分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平， 還能 夠發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及 cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性），

12、使得到的轉(zhuǎn)錄組信息更為全面，便 于進(jìn)一步注釋分類 8。與基因芯片相比， RNA-Seq 無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)探 針即可對(duì)特定條件下任意物種生長(zhǎng)發(fā)育階段整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)， 提供更精確的數(shù)字化信號(hào)、更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍， 因而其成為目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜變化活動(dòng)的強(qiáng)大且頗具優(yōu)越性 的技術(shù)手段。 一般來(lái)說(shuō)， 上述所有的高通量測(cè)序技術(shù)都能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組 測(cè)序，但不同平臺(tái)和機(jī)型的測(cè)序方法及效果差異決定了各種高通量測(cè) 序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重 （表 1），這就要求在熟悉各種高通量測(cè)序儀 內(nèi)在技術(shù)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇應(yīng)用； 另一方面， 也可嘗試結(jié)合其他 生物技術(shù)以獲得更好的數(shù)據(jù)覆蓋度和更為廉價(jià)的成本 9

13、。表 1 幾種主要測(cè)序平臺(tái)的比較 10M他2啊弊游普仰H0-1-2-»*聊99梓幣 d)47耳桿階尢窩；冃就應(yīng)科廈廣奩制鐵高產(chǎn)嵐髙匸立jt制如簡(jiǎn)肅dna r費(fèi)用量高養(yǎng)偸；誡附睚% MA2、目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要有（I）基于雜交技術(shù)，如CDNA芯片和寡聚核昔酸芯片；（2）基于測(cè)序 技術(shù)，如早先基于 Sange測(cè)序的 SAGE（SerialAnalysisofGeneExpression） 和 MpSS（Massivelypara-llelSignaturesequeneing）全長(zhǎng) DNA 文庫(kù)和 EST文庫(kù)的測(cè)序分析。現(xiàn)在對(duì)CDNA、EST等的測(cè)序工作已升級(jí)為第 二代測(cè)序技術(shù)新一代

14、測(cè)序技術(shù)較 san ge測(cè)序技術(shù)通量更高、運(yùn)行時(shí)間 更短、測(cè)序片段更長(zhǎng)現(xiàn)在通常將基于第二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分 析稱為RNA-Seq。2.1、種主要的轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較見(jiàn)表2,其中RNA 一 Seq具有以下優(yōu)勢(shì)：（l）通量高，運(yùn)用第二 代測(cè)序平臺(tái)可得到幾個(gè)到幾百億個(gè)堿基序列， 可以達(dá)到覆蓋整個(gè)基因 組或轉(zhuǎn)錄組的要求；（2）靈敏度高，可以檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的 稀有轉(zhuǎn)錄本；（3）分辨率高，RNA 一 Seq的分辨率能達(dá)到單個(gè)堿基， 準(zhǔn)確度好，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來(lái)的交叉反 應(yīng)和背景噪音問(wèn)題； 不受限制性，可以對(duì)任意物種進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組 分析，無(wú)需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，能夠直接

15、對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分 析。同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪 切位點(diǎn)及SNP、UTR區(qū)域站】。表3是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)與其他轉(zhuǎn)錄組 學(xué)技術(shù)的比較，通過(guò)比較可以看出該技術(shù)應(yīng)用的范圍。3、RNA 一 Seq的主要用途11RNA 一 seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活 動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn) 錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：（l）檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；（2）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達(dá)量、不同樣本間差異表達(dá)；（3）非編碼

16、區(qū)域功能研究，女口 microRNA、非編碼長(zhǎng) RNA （IncRNA）、RNA編輯；轉(zhuǎn)錄本 結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；（5）開(kāi)發(fā)SNPs和SSR等。表2三種轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較1°】MbimiT*盡Vfu 行 1 1叩更梟料曲第合噸芻序MH序< 坤saa50S5-2-60-2-1特播卑應(yīng)40.W1i用廣區(qū)產(chǎn)堪高：?jiǎn)?不需弄ipuir 塔或酋賤費(fèi)用直高表3 RNA-Seq與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較技術(shù)J.J 11_心人1MFSfPLNA-S 1Suiiei 測(cè)用熒允模報(bào)信巧數(shù)¥化信弓分拼宰鍛今一1町bp單si星=7-1raitt幾十到幾百俗不諸単倂全轉(zhuǎn)威組闿諂i

17、p相對(duì)墳低起姑 R.NA少3、RNA 一 Seq的主要用途11RNA 一 seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活 動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn) 錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：（I）檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；（2）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達(dá)量、不同樣本間差異表達(dá)；（3）非編碼區(qū)域功能研究，女口 microRNA、非編碼長(zhǎng) RNA （IncRNA）、RNA編輯；轉(zhuǎn)錄本 結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；（5）開(kāi)發(fā)SNPs和SSR等。4、RNA 一

18、 Seq的基本步驟11提取樣本總RNA后，根據(jù)所測(cè)RNA種類進(jìn)行分離純化。再進(jìn)而 片段化為所用測(cè)序平臺(tái)所需的長(zhǎng)度（或反轉(zhuǎn)錄后片段化），反轉(zhuǎn)錄后連接測(cè)序接頭。接著利用 PCR擴(kuò)增達(dá)到一定豐度上機(jī)測(cè)序，直到獲得 足夠的序列。所得序列通過(guò)與參考基因組比對(duì)或從頭組裝 （de no voassembl ing形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。試驗(yàn)流程，如圖1所 示。AAAAAA rrrri-boAdsRNA片J空化處乂？反.轉(zhuǎn)呆舍誡駅鍵&DZAMB A-AAATiriPCK1T壇測(cè)序文屬;¥度測(cè)存eRZ禹序列信息WMWM圖1 RNA eq試驗(yàn)流程4.1、送樣要求1）請(qǐng)?zhí)峁┱?qǐng)?zhí)峁㎡D260/28

19、0介于1.82.2之間，濃> 250ng/»總量> 40 的總RNA ,并確保RNA無(wú)降解，無(wú)污染；或提供濃度> 50ng/ , l 總量 >400n的mRNA。2）送樣管務(wù)必標(biāo)清樣品編號(hào)，管口使用 Parafilm膜密封。3) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融。4) 送樣時(shí)使用干冰運(yùn)輸。5) 質(zhì)檢以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準(zhǔn)。6) 請(qǐng)?zhí)顚懲暾乃蜆佑唵危⑻峁?RNA 電泳檢測(cè)照片，用自封袋密 封后隨同樣品一起送樣。5、序言 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)中的應(yīng)用 隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，其高通量、快速、低成本的 特點(diǎn)成為越來(lái)越多的生物學(xué)研究者在解決生物

20、學(xué)問(wèn)題時(shí)的首選，尤 其在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面更顯示出極大的潛力。轉(zhuǎn)錄組( transcriptome) 是指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，轉(zhuǎn)錄組研 究是功能基因組研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信 息與生物功能(蛋白質(zhì)組)的必然紐帶，同時(shí)相對(duì)于真核生物全基 因組測(cè)序來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的序列不含有內(nèi)含子及其它非編碼 序列，因此轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有著無(wú)可比擬的高性價(jià)比優(yōu)勢(shì)。研究基因組 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語(yǔ)言的根本規(guī)律，更需要對(duì)測(cè)序所得的海量數(shù) 據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)且全面的揭示和分析，于是生物信息學(xué)便成為一門迅速 興起的交叉學(xué)科，它位于生物、計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的交叉點(diǎn) 上，不斷深入去探索堿基

21、序列數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義。目前轉(zhuǎn)錄組 測(cè)序及分析技術(shù)可以解決新基因的深度發(fā)掘、 低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)、 轉(zhuǎn)錄圖譜繪制、可變剪接的調(diào)控、代謝途徑確定、基因家族鑒定及 進(jìn)化分析等各方面的問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基 礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等許多領(lǐng)域。5.1、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用快速獲得您感興趣的細(xì)胞、 組織或生物體內(nèi)的 mRNA 種類及其豐 度，幫助您發(fā)現(xiàn)由于可變剪接或者可變多聚腺苷化位點(diǎn)選擇所產(chǎn)生的 新mRNA isoforms;快速獲得您感興趣的不同細(xì)胞或者不同組織內(nèi)的 mRNA種類及其豐度，分析mRNA的差異表達(dá)信息。通過(guò)差異表達(dá)基 因功能分析， 可以

22、發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化， 特別是胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞 分化，機(jī)體發(fā)育， 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程中基因表達(dá)調(diào)控改變的整體 特征;如果您希望研究某種基因如何通過(guò)改變細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能，您可以對(duì)該基因進(jìn)行突變、敲除或敲低，然 后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)的RNA-se q分析，通過(guò)差異表達(dá)分析即可 以快速全面獲得您需要的信息。、哺乳動(dòng)物組織的轉(zhuǎn)錄組分析 12哺乳動(dòng)物基因組的巨大性和復(fù)雜性給其轉(zhuǎn)錄組研究帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。Mortazavi等研究員結(jié)合lllumina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)成年小鼠的腦、肺、 骨骼肌組織 RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及分析，獲得 1.4億數(shù)據(jù)，約 90%的位置與已知外顯子相

23、匹配， 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了未見(jiàn)報(bào)道的序列信息。 約3000個(gè)新鑒定的3' UTR可能在microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平和翻 譯水平調(diào)控中起重要作用；約 3000個(gè)新鑒定的 5'外顯子，提示有新的 啟動(dòng)子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，該研究利用高通量測(cè)序獲 得的海量數(shù)據(jù)，對(duì)比到約 2X105種可能剪接方式的數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定出 1.45 X05種不同的剪接方式，其中可變剪接占主導(dǎo)，3500個(gè)基因擁有 至少一種內(nèi)部剪接方式。 該研究成果表明： 高通量測(cè)序技術(shù)不僅能夠 檢測(cè)到低豐度轉(zhuǎn)錄本， 而且可以發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本， 精確識(shí)別可變剪接 位點(diǎn)，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息，這些均是芯片雜交技術(shù)或SAGE

24、文庫(kù)測(cè)序技術(shù)無(wú)法比擬的，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的有力工具。5.2、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在癌變和其他復(fù)雜疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中， 細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)模 式會(huì)發(fā)生顯著改變。如果您是臨床醫(yī)生或者從事相關(guān)研究的科學(xué)家， 希望快速全面掌握您感興趣的癌癥或者其他疾病發(fā)生中基因表達(dá)模 式的改變，對(duì)該疾病的診斷和治療提供重要解決策略； 那么， RNA-seq 可以通過(guò)對(duì)照正常樣本和疾病樣本中表達(dá)模式發(fā)生顯著變化的基因， 及其功能分析快速為您提供正確答案。 在細(xì)菌和病毒侵染時(shí)， 細(xì)胞內(nèi) 的基因表達(dá)模式也會(huì)發(fā)生顯著變化。 這些變化對(duì)機(jī)體的抗感染功能至 關(guān)重要。如果您是從事相關(guān)研究的醫(yī)生或者科學(xué)家， 希望快速全

25、面掌 握在某病毒或者細(xì)菌侵染過(guò)程中細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變特征， 為有 效抵抗病原侵染提供重要解決策略；那么 RNA-se q可以通過(guò)對(duì)照正常 樣本和侵染樣本中表達(dá)模式發(fā)生顯著變化的基因， 及其功能分析為您 提供正確答案。、癌細(xì)胞和組織中的基因融合 132009年美國(guó)密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 Christopher A. Maher等研究者 采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析， 以期找到新的基 因 融合。 該研究成功“重新發(fā)現(xiàn)”了慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中 BCR-ABL1 10的基因融合、 前列腺癌細(xì)胞和前列腺癌組織中 TMPRSS2-ERG2基因融合。另外，研究者還驗(yàn)證了在癌細(xì)胞和腫瘤 組織

26、中導(dǎo)致嵌合轉(zhuǎn)錄的新的基因融合（ SLC45A3-ELK4 ）。表征癌細(xì) 胞中特定基因組失常在確定癌癥的治療目標(biāo)中有重要的作用， 因此確 定誘發(fā)癌癥的基因失常是癌癥研究的一個(gè)主要手段。 由癌細(xì)胞中染色 體重新排列而導(dǎo)致的基因融合被認(rèn)為是一些最普遍的 “癌癥基因 ”產(chǎn) 生的主要原因。由于它們?cè)谥掳┻^(guò)程中的誘發(fā)作用和精確地癌細(xì)胞局 限性，融合基因可以描繪出理想的診斷標(biāo)記物和合理的治療目標(biāo)物。 周期性基因融合， 與血液惡性腫瘤、 罕見(jiàn)骨腫瘤及軟組織腫瘤密切相 關(guān)，并且最近還發(fā)現(xiàn)了其在一些常見(jiàn)的實(shí)體瘤中的作用，如：前列腺 癌和肺癌。Christopher A. Maher等人通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)

27、 序及后續(xù)的qRT-PCR、FISH、Array CGH或高密度SNP Array的驗(yàn)證， 證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)τ跈z測(cè)基因融合是一個(gè)非常有效地工具。另外， 在Christopher A. Maher等人用 lllumina GenomeAnalyzer進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序的研究中， 為了消除假陽(yáng)性數(shù)據(jù)， 克服缺少長(zhǎng)讀子的深度及減少局 部基因定位排列中的短讀子的難度， 長(zhǎng)讀子和短讀子的序列數(shù)據(jù)被并 入到一起進(jìn)行分析。 結(jié)果證明， 這種整體化的處理方法極有效地減少 了假候選基因并大大增加了試驗(yàn)可行的候選基因的比率。 一個(gè)重要的 局限性則是，當(dāng)鄰側(cè)的兩個(gè)基因只引起調(diào)控序列的融合而不是轉(zhuǎn)錄序 列的時(shí)候，則不

28、能使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序這個(gè)方法。但無(wú)論如何，該研究建 立了基于轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因融合的可靠方法路線， 為 系統(tǒng)界定癌癥相關(guān)突變開(kāi)辟了重要途徑。5.3、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用 在植物的正常生長(zhǎng)，抗旱、抗逆、以及優(yōu)良品系培育等過(guò)程中細(xì) 胞的基因表達(dá)模式會(huì)發(fā)生顯著變化。 如果您是從事農(nóng)業(yè)研究的科學(xué)家 或農(nóng)學(xué)家，RNA-seq可以通過(guò)對(duì)照正常樣本和您感興趣樣本中表達(dá)模 式發(fā)生顯著差異的基因讓您快速全面掌握在您感興趣的植物性狀中 起重要功能的基因，給力您育種或者相關(guān)農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究的進(jìn)程。、擬南芥可變剪接研究 14SergeiA.Filichkin 等研究者采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)擬南芥 進(jìn)行可變

29、剪接分析， 發(fā)現(xiàn)42%以上具有內(nèi)含子的基因具備可變剪接形 式，這個(gè)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EST測(cè)序方法（20%-30% ）?？勺兗艚愚D(zhuǎn)錄本 多數(shù)具有提前終止密碼子（PTC+），PTC+可作為無(wú)義介導(dǎo)的mRNA 降解監(jiān)控機(jī)制（ NMD ）的靶標(biāo)，或通過(guò)調(diào)控非預(yù)期剪接和轉(zhuǎn)錄機(jī)制 （RUST）來(lái)調(diào)控功能轉(zhuǎn)錄本水平。該研究還發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境因素脅 迫下，PTC+及相關(guān)剪接變體的相對(duì)比率會(huì)隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變。研究成果 還提示，和動(dòng)物體內(nèi)類似，NMD和RUST同樣在植物體內(nèi)的基因表達(dá) 中廣泛存在并扮演非常重要的角色。6、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和展望前景 隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步， 我們能夠?qū)D(zhuǎn)錄組開(kāi)展更為深入的測(cè) 序工作，

30、能夠發(fā)現(xiàn)更多、更可靠的轉(zhuǎn)錄子，目前的大規(guī)模并行測(cè)序技 術(shù)已經(jīng)徹底改變了我們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的研究方法， 測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量也在不 斷提高，得到的信息量也在爆炸式增長(zhǎng)。 然而和其他所有新生技術(shù)一 樣，RNA-Seq技術(shù)也面臨著一系列新問(wèn)題：其一是龐大的數(shù)據(jù)量所帶 來(lái)的信息學(xué)難題， 比如如何最好地詮釋和比對(duì)鑒定多個(gè)類似的同源基 因，如何確定最佳測(cè)序量， 獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄圖譜等 15；其二是如何 針對(duì)更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組來(lái)識(shí)別和追蹤所有基因中罕見(jiàn) RNA 亞型的表達(dá) 變化。有可能提前實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的將是使用配對(duì)末端測(cè)序和單分子測(cè) 序等更新的測(cè)序技術(shù)， 以及使用更長(zhǎng)的讀段來(lái)增加測(cè)序深度和覆蓋度16 ；其三， 目前的高通量

31、測(cè)序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量， 這使 得來(lái)源極為有限的生物樣品分析受到限制， 因此如何對(duì)單細(xì)胞或少量 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。 最近這方面的研究也取 得了一定進(jìn)展，如Tang等17建立了一種mRNA-Seq方案，它以PCR 為基礎(chǔ)擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的 mRNA 轉(zhuǎn)錄組，成功分析了取自小鼠四細(xì)胞 胚胎時(shí)期的單個(gè)卵裂球的轉(zhuǎn)錄組。然而該方法只能捕捉帶有 poly（A） 尾巴的mRNA，也不能檢測(cè)絕大多數(shù)較長(zhǎng)的mRNA（大于3 kb）的5末端, 同時(shí)也不能保留原轉(zhuǎn)錄子的方向信息。 除此之外還有一些新的針對(duì)低 數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究的技術(shù)正在不斷被開(kāi)發(fā) 18。最后，標(biāo)準(zhǔn)的 RNA-Se q

32、技術(shù)不能提供序列轉(zhuǎn)錄的方向信息，而這對(duì)于轉(zhuǎn)錄組注釋尤 為重要，采用 single-strand sequencin©19】禾口 strandspecificsequencing° 技術(shù)能很好的解決這一問(wèn)題 ,或?qū)⒊蔀?RNA-Seq 技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重 要方向。雖然RNA-Seq技術(shù)還面臨著種種困難，但作為一個(gè)剛剛起步 的新技術(shù)RNA-Seq已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：既 能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的 “數(shù)字化 的基因表達(dá)譜，而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的San ger EST測(cè)序 要低,有人甚至提出了 RNA-Seq 最終取代基因芯片的

33、猜測(cè)。然而就目 前來(lái)看，作為兩個(gè)高通量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)， 在應(yīng)用的某些方面既 存在重疊和競(jìng)爭(zhēng)也存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)， 一種技術(shù)能彌補(bǔ)另一種技術(shù)遺漏的 部分, 通常對(duì)一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題的回答需要不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)的協(xié)同配合， 例如序列捕獲（Sequenee Capture技術(shù)就是結(jié)合了芯片和深度測(cè)序，利 用芯片探針捕獲待測(cè)片段， 再用深度測(cè)序技術(shù)分析核酸序列。 但基因 芯片的缺點(diǎn)，就在于它是一個(gè) “封閉系統(tǒng) ”，它只能檢測(cè)人們已知序列 的特征(或有限的變異)；而RNA-Seq的強(qiáng)項(xiàng)，就在于它是一個(gè) 開(kāi)放系 統(tǒng)”，它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)， 相信隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展和測(cè)序成本的進(jìn)一

34、步降低， RNA-Seq 必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。參考文獻(xiàn)：1 Lockhart DJ, Winzeler EA. Genomics, gene expressionand DNA arrays.Nature, 2000, 405(6788): 827-36.2 Costa V, Angelini C, De Feis I, Ciccodicola A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J BiomedBiotechnol, 2010, 2010: 853916.3 Wang Z, Gerstein

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