秀麗隱桿線蟲中RNA干擾作用的遺傳分析

1、秀麗隱桿線蟲中RNA干擾作用的遺傳分析姓名 摘要：秀麗隱桿線蟲是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲。RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）現(xiàn)象，是研究基因功能的一種快速和高通量的方法。本次實驗通過飼喂的方法，觀察外源RNA分子對秀麗隱桿線蟲發(fā)育的影響，從而了解RNA干擾的原理、特性及其應(yīng)用。通過此次實驗，我們達到了實驗?zāi)康?，取得了良好的實驗效果。關(guān)鍵詞：秀麗隱桿線蟲、RNA干擾（RNAi）、飼喂法1引言秀麗隱桿線蟲是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲。在理想的條件下（充足食物，20）生命周期大約為4d。秀麗隱桿線蟲成體長11.5mm，體寬約70m，全身透

2、明，以細菌為食，全身共有959個細胞。研究用的通常是秀麗隱桿線蟲野生型（N2）。從1965年開始，Sydney Brenner以線蟲為材料研究發(fā)育和神經(jīng)生物學(xué)，現(xiàn)在已經(jīng)成為經(jīng)典模式生物之一。線蟲性別是由常染色體和性染色體組的比例決定，有兩種性別形式：雌雄同體和雄蟲。雌雄同體的性染色體為XX，而雄蟲性染色體為X0。雌雄同體的秀麗隱桿線蟲既產(chǎn)生卵，又產(chǎn)生精子，可以與雄體交配，也可以自體受精進行繁殖，但雌雄同體之間不能異體受精。在雌雄同體自交繁殖中以0.2%的頻率產(chǎn)生雄體（是減數(shù)分裂時性染色體不分開造成的）；而雄體與雌雄同體交配其后代兩種性別比例為1:1。線蟲有單基因突變形成的表型，例如：運動不協(xié)調(diào)

3、（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成這些表型的基因有很多個，分別分布于各條染色體上。這些易于觀察的表型作為遺傳標(biāo)記，給線蟲的經(jīng)典遺傳學(xué)實驗帶來了極大的便利。此外，線蟲還有許多組織特異性標(biāo)記的品系。秀麗隱桿線蟲的生命周期很短，20僅需4d。卵在通過受精囊時受精形成一層堅硬的幾丁質(zhì)的外殼，在母體內(nèi)就開始分裂。從母體產(chǎn)出的卵大約處于30個細胞期。胚胎發(fā)生很有規(guī)律，從卵中孵化出約有550個細胞的幼蟲。從孵化到成體，線蟲經(jīng)歷4個幼蟲階段（L1L4）和4次蛻皮，在身體大小和細胞數(shù)目兩方面都有增長。蛻皮的時間（20）分別是孵化后13、21

4、.5、29.5和41h；身體長度分別是350、470、640和890m。秀麗隱桿線蟲孵化后約50h開始產(chǎn)卵，每個雌雄同體可產(chǎn)200到300卵。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（PTGS）現(xiàn)象，是研究基因功能的一種快速和高通量的方法。目前，在線蟲中發(fā)展出3種不同的RNAi實驗操作方法： 注射（injection）dsRNA；將線蟲浸泡（soaking）于一定濃度的dsRNA溶液中； 用表達dsRNA的工程菌（E.coli）飼養(yǎng)（feeding）線蟲。這3種方法各有優(yōu)缺點，其中飼養(yǎng)法簡單易行，適合高通量的基因功能篩選研究，已有用此

5、方法對線蟲全基因組進行篩選的報道。此次實驗培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲的整體步驟是：提取秀麗隱桿線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA經(jīng)過RT-PCR產(chǎn)生Gene，Gene經(jīng)過雙酶切產(chǎn)生Gene片段。另外L4440質(zhì)粒雙酶切形成線性L4440質(zhì)粒。Gene片段與線性L4440質(zhì)粒經(jīng)過T4 DNA連接酶連接形成L4440質(zhì)粒-Gene，L4440質(zhì)粒-Gene轉(zhuǎn)入到E.coli HT115（DE3）中進行陽性克隆。陽性克隆后進行PCR鑒定。之后將陽性克隆產(chǎn)物進行IPTG誘導(dǎo)形成Gene-dsRNA，將其通過飼喂法導(dǎo)入到秀麗隱桿線蟲，能產(chǎn)生對目的基因表達和功能的特異性干擾，從而培養(yǎng)出RNAi型秀

6、麗隱桿線蟲。2材料和方法2.1 材料、試劑和器材實驗材料：秀麗隱桿線蟲野生型（N2）、大腸桿菌OP50、大腸桿菌HT115（DE3）、6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達不同gene dsRNA的質(zhì)粒，對應(yīng)的性狀編號分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon）實驗試劑：LB液體培養(yǎng)基、NGM固體培養(yǎng)基實驗器材：實體顯微鏡、顯微鏡、粘蟲器（pick）、培養(yǎng)皿、錐形瓶、微量移液器、藍槍頭、黃槍頭、白槍頭、記號筆、酒精燈、火柴、高壓蒸汽滅菌鍋、封口膜2.2 方法2.2.1活化大腸桿菌OP50打開超凈工作臺的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開始無菌操作。取一個滅菌后

7、的15mL離心管，用微量移液器向其加入3mL LB液體培養(yǎng)基，再向其中加入300L大腸桿菌OP50。將15mL離心管放入37恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)過夜（812h）。2.2.2 大腸桿菌OP50涂平板大腸桿菌OP50振蕩培養(yǎng)過夜后，打開超凈工作臺的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開始無菌操作。用微量移液器取200L菌液加入到NGM培養(yǎng)基平板中，輕微轉(zhuǎn)動平板使菌液散開，用封口膜將平板封口。將接種后的平板置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)67小時。2.2.3 向NGM培養(yǎng)基平板中接種線蟲從老師提供的線蟲培養(yǎng)板中選取有卵的或者L1、L2期雌雄同體線蟲（生長時期保證一致），用粘蟲器（pick）挑取這些線蟲接種到NGM培

8、養(yǎng)基平板中，用封口膜將平板封口。記錄接種的線蟲所處的生長時期和接種時間，根據(jù)線蟲生長時期與溫度的關(guān)系與自己的實際時間情況合理確定線蟲培養(yǎng)方案，選擇在不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱（20和25）中的培養(yǎng)時間，將線蟲培養(yǎng)至第四幼蟲期（L4期線蟲）。2.2.4 活化干擾菌株和涂干擾板在步驟2.2.3進行的期間，要進行活化干擾菌株和涂干擾板。打開超凈工作臺的紫外燈5min，之后關(guān)閉紫外燈開始無菌操作。取7個滅菌后的15mL離心管，用微量移液器向其中加入3mL LB液體培養(yǎng)基和3L Amp，再分別加入300Lbli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2和lon6種干擾菌株以及陰性對照HT115菌株，用微

9、量移液器吹吸混勻。將這7個15mL離心管做好標(biāo)記，放入37恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)過夜（1216h）。之后取7個NGM培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺中，用微量移液器分別取200300L 7種活化好的菌液加入到NGM培養(yǎng)基平板中，輕微轉(zhuǎn)動平板使菌液散開，用封口膜將平板封口，在平板的皿底和皿蓋上同時做好標(biāo)記。將干擾板置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)616小時。此步驟要求這7個干擾板接種的菌株培養(yǎng)好的時間與步驟2.2.3中將線蟲培養(yǎng)至第四幼蟲期（L4期線蟲）的時間一致。2.2.5向7個干擾板中挑取L4期線蟲步驟2.2.4中7個干擾板接種的菌株培養(yǎng)好后，步驟2.2.3中的線蟲也培養(yǎng)至第四幼蟲期（L4期線蟲）。此時用粘蟲器

10、（pick）分別向7個干擾板中挑取10條L4期雌雄同體線蟲，用封口膜將平板封口。挑取線蟲后將干擾板置于20恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。2.2.6 挑取45條L4期雌雄同體線蟲到新的干擾板中2d后挑取45條L4期雌雄同體線蟲到新的干擾板中，用封口膜將平板封口。與原干擾板共同置于20恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。2.2.7 觀察兩個干擾板中的后代表型，統(tǒng)計突變型出現(xiàn)的頻率3結(jié)果此次實驗中使用了6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達不同gene dsRNA的質(zhì)粒），對應(yīng)的性狀編號分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sma-2、lon。同時還使用了起陰性對照作用的RNA干擾菌株HT115，即

11、轉(zhuǎn)入了RNA干擾質(zhì)粒空載體L4440的HT115。（1）接種了RNA干擾菌株HT115的平板起陰性對照的作用，線蟲不發(fā)生突變。如圖一所示。圖一 陰性對照的平板中線蟲不發(fā)生突變圖一中的線蟲都是雌雄同體線蟲，個體比雄蟲稍大，產(chǎn)卵器位于身體的中部，體內(nèi)可見卵或胚胎。圖二是在10×低倍鏡下觀察的HT115陰性對照線蟲。圖二10×低倍鏡下觀察的HT115陰性對照線蟲（2）接種了bli-2干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲身上表皮起泡（尤其是頭部），線蟲比野生型稍小。如圖三所示。圖三 接種bli-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲圖三中可以很明顯地觀察到突變線蟲頭部表皮

12、起泡。（3）接種了dpy-2干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲粗短，身體向左轉(zhuǎn)彎，身體僵硬，幼蟲正常。如圖四所示。圖四 接種dpy-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲圖四中可以很明顯地觀察到突變線蟲粗短，身體向左轉(zhuǎn)彎，身體僵硬。（4）接種了dpy-5干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是成蟲非常粗短，幼蟲正常。如圖五所示。圖五 接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲AB圖五中“A”是突變線蟲，“B”是未突變線蟲（即野生型線蟲）。二者對比可以很明顯地看出突變性狀。圖六是在10×低倍鏡下觀察接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲。

13、A圖六10×低倍鏡下接種dpy-5干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲BC圖六中“A”是未突變線蟲（即野生型線蟲），“B”和“C”是突變線蟲。二者對比可以很明顯地看出突變性狀。（5）接種了him干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是在干擾板中雄蟲出現(xiàn)率提高。如圖七所示。ABCDE圖七 接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲和雌雄同體線蟲圖七中“A”和“B”是雄蟲，“C”、“D”和“E”是雌雄同體線蟲。雄蟲比雌雄同體線蟲身體細、顏色淺，尾部的交配器呈扇形（三角形）。不過雖然接種了him干擾菌株的干擾板中雄蟲出現(xiàn)率提高，但是雄蟲出現(xiàn)的頻率仍然較低。圖八是在10×低倍鏡

14、下觀察接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲和雌雄同體線蟲。圖八10×低倍鏡下觀察接種him干擾菌株的干擾板中雄蟲和雌雄同體線蟲ABCD圖八中“A”是雄蟲，“B”、“C”和“D”是雌雄同體線蟲。圖中可以很明顯地看出雄蟲比雌雄同體線蟲身體細、顏色淺，尾部的交配器由于被雌雄同體線蟲擋住無法觀察到扇形（三角形）。還可以看到雄蟲體內(nèi)的消化管和儲精管。（6）接種了sma-2干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是線蟲比野生型短小。如圖九所示。圖九 接種sma-2干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲 AB實驗中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲比野生型線蟲短小的性狀并不明顯，較難觀察。圖九中“A”（突變線蟲

15、）和“B”（未突變線蟲）兩只線蟲對比可以較清楚地觀察出突變性狀。（7）接種了lon干擾菌株的干擾板中，線蟲可以發(fā)生性狀突變，突變特征是線蟲各個發(fā)育階段均較野生型長，頭部和尾部變尖。如圖十所示。圖十 接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲AB實驗中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲比野生型線蟲長的性狀并不明顯，較難觀察。圖十中“A”（突變線蟲）和“B”（未突變線蟲）兩只線蟲對比可以較清楚地觀察出突變性狀。圖十一是在10×低倍鏡下觀察接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲。圖十一10×低倍鏡下觀察接種lon干擾菌株的干擾板中突變線蟲和未突變線蟲ABC實驗中發(fā)現(xiàn)，突變線蟲比野生型

16、線蟲長的性狀并不明顯，較難觀察。圖十一中“A”（突變線蟲）和“B”、“C”（未突變線蟲）的對比可以較清楚地觀察出突變性狀。4討論RNAi是一個奇特的生物現(xiàn)象，在許多物種中特殊的dsRNA的表達會導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解使得該基因的功能幾乎完全喪失。應(yīng)用這項技術(shù)可以方便的找出突變的表型而不必去費力的分離一個突變的基因本從而大大加快了研究的進程。RNA干擾機制是如下所示：第一步（起始階段），dsRNA在內(nèi)切核酸酶（Dicer酶）作用下加工裂解形成2123nt的siRNA；第二步（效應(yīng)階段），是由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing compl

17、ex，RISC），由RISC介導(dǎo)切割靶向mRNA分子中與siRNA互補的區(qū)域，從而達到干擾基因表達的作用。秀麗隱桿線蟲的RNAi方法有顯微注射法、浸泡法和飼喂法。顯微注射法是最初的RNA干擾試驗采用的經(jīng)典方法，是通過直接注射dsRNA到雌雄同體線蟲的生殖器官，然后檢查它親代以及后代的表型。它的不足之處在于效率低，不適合用此法進行高通量篩選，同時干擾效果會隨著細胞分裂而不斷降低，不適合進行晚期表達基因研究。浸泡法是將線蟲浸泡在dsRNA溶液中，但是干擾成功率不高。飼喂法是給線蟲飼喂表達dsRNA的大腸桿菌，從而產(chǎn)生RNA干擾效果，該方法成功率近似于微注射，可大批量培養(yǎng)，成本低，主要的缺點是需要在

18、細菌中表達dsRNA。目前已有86%的線蟲基因有現(xiàn)成的菌株可用。此次實驗培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲的整體步驟是：提取秀麗隱桿線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA經(jīng)過RT-PCR產(chǎn)生Gene，Gene經(jīng)過雙酶切產(chǎn)生Gene片段。另外L4440質(zhì)粒雙酶切形成線性L4440質(zhì)粒。Gene片段與線性L4440質(zhì)粒經(jīng)過T4 DNA連接酶連接形成L4440質(zhì)粒-Gene，L4440質(zhì)粒-Gene轉(zhuǎn)入到E.coli HT115（DE3）中進行陽性克隆。陽性克隆后進行PCR鑒定。之后將陽性克隆產(chǎn)物進行IPTG誘導(dǎo)形成Gene-dsRNA，將其通過飼喂法導(dǎo)入到秀麗隱桿線蟲，能產(chǎn)生對目的基因表達和功能的特異

19、性干擾，從而培養(yǎng)出RNAi型秀麗隱桿線蟲。本實驗所用的載體是L4440 T7雙鏈載體，大小是2790bp。該載體含有Amp抗性基因，可以在含有Amp的NGM平板中生長。本實驗所用的RNA干擾菌株是HT115（DE），其中有一個Rnc基因突變，使得特異性降解dsRNA的內(nèi)切酶RNase的基因失活，這樣有利于dsRNA的形成，可穩(wěn)定表達目的基因dsRNA。另外，此菌株中含有DE3 lysogen，它可在T7啟動子的控制下進行基因轉(zhuǎn)錄。此次實驗中使用了6種不同的RNA干擾菌株HT115（含有能表達不同gene dsRNA的質(zhì)粒），對應(yīng)的性狀編號分別為：bli-2、dpy-2、dpy-5、him、sm

20、a-2、lon。同時還使用了起陰性對照作用的RNA干擾菌株HT115，即轉(zhuǎn)入了RNA干擾質(zhì)粒空載體L4440的HT115。在實驗操作過程中還有以下幾個方面需要注意：（1）LB液體培養(yǎng)基的配制方法：配方：胰蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母粉提取物5g/L。用蒸餾水配制，配好后置于高壓蒸汽滅菌鍋中121滅菌15分鐘。（2）NGM培養(yǎng)基的配制方法：配制150mL NGM培養(yǎng)基：NaCl 0.45g、Agur 2.6g、Tryptone0.375g、ddH2O146mL，之后置于高壓蒸汽滅菌鍋中120滅菌15分鐘。然后在無菌條件下加入下列滅菌的溶液：CaCl2（1M）0.15mL、MgSO4（1M） 0.15mL、磷酸緩沖液（1M，pH=6）3.7