種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的表型特征研究

1、種植于硅橡膠膜上的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的表型特征研究    作者：郭志良，周躍，成敏，曹國永，李華壯，滕海軍【關(guān)鍵詞】  纖維環(huán)細(xì)胞；硅橡膠膜；逆轉(zhuǎn)錄Phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus cells cultured on flexible silicone membranes【Abstract】 AIM: To compare the phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus (AF) cells cultured on fl

2、exible silicone membranes with the same cells cultured in plastic plates. METHODS: The morphology of AF cells cultured in different substrates was observed under an inverted phasecontrast microscope and a transmission electron microscope. Proteoglycan was stained with toluidine blue for observing it

3、s expression. The contents of collagen type, and aggrecan mRNA were determined by RTPCR. The expression of integrin 1 was monitored by flow cytometry. Cell adhesion to silicone membranes was also measured. RESULTS: The AF cells cultured in different substrates were morphologically undistinguishable.

4、 Toluidine blue staining showed that there was also no difference between AF cells cultured on flexible silicone membranes and in plastic plates. The cells growing in different substrates expressed the same levels of collagen type, and aggrecan mRNA and integrin 1. AF cells grew well on silicone mem

5、branes. CONCLUSION: AF cells cultured on flexible silicone membranes maintain the stability of phenotype and may be appropriate for further studying the metabolic responses to mechanical stimuli at the cellular level.【Keywords】 annulus fibrosus cell; silicone membrane; reverse transcriptasepolymeras

6、e chain reaction; flow cytometry【摘要】 目的：比較種植于硅橡膠膜或塑料培養(yǎng)板的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞的表型特征. 方法：利用倒置相差顯微鏡及透射電鏡觀察種植于不同基質(zhì)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)的變化；利用甲苯胺藍(lán)染色觀檢測蛋白多糖的表達(dá)情況；通過RTPCR法檢測，型膠原及聚集蛋白聚糖mRNA的表達(dá)情況；采用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞表面整合素1的表達(dá)情況；同時(shí)檢測了纖維環(huán)細(xì)胞在硅橡膠膜上的黏附情況. 結(jié)果：種植于不同基質(zhì)的纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察無明顯差別；在兩種基質(zhì)上的纖維環(huán)細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色無差異；，型膠原及聚集蛋白聚糖mRNA及細(xì)胞膜整合素1的表達(dá)亦無明顯差異；纖維環(huán)細(xì)胞可以黏附于

7、硅橡膠膜上生長. 結(jié)論：種植于硅橡膠膜上的纖維環(huán)細(xì)胞表型特征無改變，為進(jìn)一步研究力學(xué)刺激對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 纖維環(huán)細(xì)胞；硅橡膠膜；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；流式細(xì)胞術(shù)0引言下腰痛是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，雖然引起下腰痛的原因很多，但是椎間盤退變?nèi)允瞧渲饕蛩?-2. 目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，椎間盤退變是一個(gè)由生物化學(xué)和生物力學(xué)因素相互作用的復(fù)雜的病理過程. 由于椎間盤周圍的肌肉、韌帶以及椎間盤內(nèi)的靜水壓等因素，椎間盤始終處于負(fù)荷狀態(tài)，尤其是椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞總是不斷地受到不同形式的拉伸應(yīng)力. 為了從細(xì)胞水平研究生物力學(xué)因素對(duì)細(xì)胞的影響，很多研究者設(shè)計(jì)出不同的實(shí)驗(yàn)裝置，對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞施

8、加不同形式的拉伸應(yīng)力3-4. 我們也自行設(shè)計(jì)一套對(duì)單層生長細(xì)胞進(jìn)行周期性張應(yīng)變的實(shí)驗(yàn)裝置，為對(duì)細(xì)胞施加張應(yīng)力，首先需要將纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)于彈性硅橡膠膜上，因此有必要對(duì)培養(yǎng)于新的基質(zhì)上的細(xì)胞表型穩(wěn)定性進(jìn)行確認(rèn). 細(xì)胞生長基質(zhì)可影響細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)我們比較了培養(yǎng)于硅橡膠膜和細(xì)胞培養(yǎng)板上的纖維環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)情況.1材料和方法1.1材料SD大鼠(1月齡)由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. DMEM培養(yǎng)基和型膠原酶為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為PAA公司產(chǎn)品，纖維連接素為Roche公司產(chǎn)品，Hepes為Amresco公司產(chǎn)品，TRIzol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，一步法RTPC

9、R試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗整合素1單抗為BD公司產(chǎn)品. 硅橡膠膜為Dow Corning公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)板為Corn    ；3, 6：可聚蛋白聚糖.圖4不同培養(yǎng)基質(zhì)上的纖維環(huán)細(xì)胞型膠原、型膠原和可聚蛋白聚糖核心蛋白mRNA的表達(dá)（略）圖5型膠原、型膠原和可聚蛋白聚糖核心蛋白mRNA的表達(dá)的半定量分析（略）2.3整合素1的表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)中未檢測出在不同基質(zhì)生長的纖維環(huán)細(xì)胞，整合素1表達(dá)的不同，其相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為819±30和814±33（P>0.05，圖6）.圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測不同培養(yǎng)基質(zhì)的纖維環(huán)細(xì)胞整合素

10、1表達(dá)情況（略）2.4細(xì)胞黏附接種于硅橡膠膜上的纖維環(huán)細(xì)胞，在接種后3，6，12和24 h的貼壁率分別為（65±8）%，（81±7）%，（91±10）%和（99±3）%，與在培養(yǎng)板上的相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）. 在施加3，6，12 h的周期性張應(yīng)變后細(xì)胞的脫落率分別為（5.6±1.0）%，（5.2±1.1）%，（5.0±0.9）%，與未施加應(yīng)變組（5.8±0.9）%，（5.4±0.8）%，（5.0±0.7）%比較無差異（P>0.05）.3討論在脊柱運(yùn)動(dòng)過程中，纖維環(huán)細(xì)胞受到

11、張應(yīng)力刺激，機(jī)械刺激可以影響纖維環(huán)細(xì)胞的代謝已為很多研究者所接受. 研究者設(shè)計(jì)了很多的實(shí)驗(yàn)裝置，可以在細(xì)胞水平研究纖維環(huán)細(xì)胞對(duì)應(yīng)力刺激的代謝響應(yīng)6-7. 我們也自行設(shè)計(jì)了一套實(shí)驗(yàn)裝置，為了對(duì)細(xì)胞施加應(yīng)力，必須將細(xì)胞培養(yǎng)于彈性硅橡膠膜上，因此有必要對(duì)培養(yǎng)于硅橡膠膜上的纖維環(huán)細(xì)胞的表型穩(wěn)定性進(jìn)行研究. 在體外高密度培養(yǎng)的纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)纖維軟骨特異性的基質(zhì)蛋白，可以表達(dá)型膠原、型膠原和蛋白多糖5. 本實(shí)驗(yàn)中，我們將大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)于纖維連接素包被的彈性硅橡膠膜上，以便對(duì)其施加應(yīng)力刺激. 根據(jù)Brodkin等8的研究，纖維連接素、型膠原或型膠原基質(zhì)不影響軟骨細(xì)胞的形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的形

12、成以及細(xì)胞骨架的構(gòu)造. 我們的結(jié)果提示纖維連接素包被的彈性硅橡膠膜上生長的纖維環(huán)細(xì)胞可以保持其表型穩(wěn)定，與培養(yǎng)板上的細(xì)胞沒有差別. 整合素作為一種重要的細(xì)胞黏附分子，可以介導(dǎo)細(xì)胞與周圍基質(zhì)的相互作用. 在許多種細(xì)胞中，整合素同樣參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡9-12. Nettles等13發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)整合素1亞基. 在本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)在不同基質(zhì)的纖維環(huán)細(xì)胞表達(dá)同樣的整合素1亞基，二者并無不同. 另外，細(xì)胞在硅橡膠膜上的貼壁率與在培養(yǎng)板上沒有區(qū)別. 這些結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)條件對(duì)于纖維環(huán)細(xì)胞的生長是合適的. 最后，我們對(duì)生長于硅橡膠膜上的細(xì)胞給以應(yīng)變?yōu)?0%, 頻率2

13、Hz的周期性張應(yīng)變，細(xì)胞沒有從彈性膜上脫落下來.我們研究說明，纖維連接素包被的彈性硅橡膠膜具有好的生物相容性，大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞可以在其上生長，并保持起生物學(xué)特性. 本實(shí)驗(yàn)裝置可以用于周期性張應(yīng)變對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞在細(xì)胞水平的影響研究.【參考文獻(xiàn)】1 Schwarzer AC, Aprill CN, Derby R, et al. The relative contributions of the disc and the zygapophyseal joint in chronic low back pain J. Spine, 1994, 19: 801-806.2 Zhao WG, Wang

14、 JT, Liu M. Structure and histochemical changes of cervical intervertebral disc in cervical spondylosisJ. J Fourth Mil Med Univ, 2004, 25(10):937-939.3 Brown TD. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: A review J. J Biomech, 2000, 33: 3-14.4 張，王美青，王景杰，等. 機(jī)械壓力對(duì)兔髁突軟骨堿性磷酸酶活性及細(xì)胞增殖的影響J.

15、第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003, 24(17):1563-1565.5 Poiraudeau S, Monteiro I, Anract P, et al. Phenotype characteristics of rabbit intervertebral disc cells: Comparison with cartilage cells from the same animalsJ. Spine, 1999, 24: 837-844.6 Rannou F, Richette P, Benallaoua M, et al. Cyclic tensile stretch modulates proteoglycan production by intervertebral disc annulus fibrosus cells through production of nitrite oxide J. J Cell Biochem, 2003, 90:148-157.7 Elfervi