分子遺傳學(xué)復(fù)習(xí)題

1、分子遺傳學(xué)復(fù)習(xí)題名詞解釋：DNA 甲基化 (DNA methylation ):是指由 DNA 甲 基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo),催化甲基基團(tuán)從 S-腺昔甲硫氨酸向胞 嚅嚏的C-5位點(diǎn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程.ENCODE戈ij (The Encyclopedia of DNAElements Project):即“DNA元件百科全書方案,簡(jiǎn)稱 ENCODE 方案,是在完成人類基因組全序列測(cè)定后的2003年9月由美國(guó)國(guó)立人類基因組研究所(National HumanGenome Research Institute , NHGRJ 組織的又一個(gè)重 大的國(guó)際合作方案,其目的是解碼基因組的藍(lán)圖,鑒定 人類基因組中的和還不知功

2、能的多個(gè)物種的保守 序列等在內(nèi)的所有功能元件.ENCODE劃的實(shí)施分為3個(gè)階段：試點(diǎn)階段(a pilot phase )、技術(shù)開展階段 (a technology development phase ) 和生產(chǎn)階段 ( a producttion phase ).gRNA (guide RNA):既指導(dǎo) RNA(gRNA guide RNA),能通過(guò)正常的堿基配對(duì)途徑,或通過(guò)CH U配對(duì)方式與mRNAh的互補(bǔ)序列配對(duì),指導(dǎo)編輯的進(jìn)行.GT-AG規(guī)律(GT-AG rule ):真核生物所有編碼 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,其 RNAttf體在內(nèi)含子和外顯子交界 處有兩個(gè)較短的保守序列,內(nèi)含子的左端均為 G

3、T,右端 均為AG此規(guī)律稱 GT-AG規(guī)律.miRNA即小RNA長(zhǎng)度為22nt左右,5'端為磷 酸基團(tuán)、3'端為羥基.miRNA廣泛存在于真核生物中, 不具有開放閱讀框架,不編碼蛋白質(zhì),其基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu),在RNasem酶切后以雙鏈形式存在,是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非 編碼RNA,它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控.RNA編輯(RNA editing):是指通過(guò)堿基修飾、核背酸插入或刪除以及核昔酸替換等方式改變RNA勺堿基序列的轉(zhuǎn)錄后修飾方式.RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA Induced Silencing Complex, RISC):與siR

4、NA結(jié)合后可識(shí)別并切斷 mRNARNA 指導(dǎo) 的 DNA 甲基化(RNA Directed DNA Methylation RDDM：活性RISC進(jìn)入核內(nèi),指導(dǎo)基因發(fā) 生DNA的甲基化.密碼子擺動(dòng)假說(shuō)( wobble hypothesis ):密碼子 的第1, 2位核昔酸(5'3')與反密碼子的第2, 3核昔酸正常配對(duì)；密碼子的的第3位與反密碼子的第1位配對(duì)并不嚴(yán)謹(jǐn),當(dāng)反密碼子的第1位為U時(shí)可識(shí)別密碼子第3位的A或G而G那么可識(shí)別U或C, I (次黃喋 吟)可識(shí)別U或C或A.比較基因組學(xué) ( comparative genomics ): 是門 通過(guò)運(yùn)用數(shù)理理論和相應(yīng)計(jì)算機(jī)程序

5、,對(duì)不同物種的基 因組進(jìn)行比較分析來(lái)研究基因組大小和基因數(shù)量、基因 排列順序、編碼序列與非編碼序列的長(zhǎng)度、數(shù)量及特征 以及物種進(jìn)化關(guān)系等生物學(xué)問(wèn)題的學(xué)科.表觀遺傳變異(epigenetic variation ):基因的 堿基序列未發(fā)生改變,而是由于DNA甲基化,組蛋白的乙?；蚏NA輯等修飾導(dǎo)致基因活性發(fā)生了變化,使 基因決定的表型發(fā)生變化,且可遺傳少數(shù)世代,但這種 變化是可逆的.超基因家族(supergene family ):是DNAR列相 似,但功能不一定相關(guān)的假設(shè)干個(gè)單拷貝基因或假設(shè)干組基 因家族的總稱.沉默子(silencer ): 一種轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控元件,當(dāng)其 結(jié)合特異蛋白因子時(shí),對(duì)

6、基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用.特點(diǎn)很 象增強(qiáng)子,但不增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄,而是減弱轉(zhuǎn)錄,故稱負(fù)增強(qiáng) 子.代謝組學(xué)(metabolomics):是對(duì)某一生物或細(xì)胞 在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行 定性和定量分析的一門新學(xué)科.端粒(telomere):是由獨(dú)特的DNA序列及相關(guān)蛋 白質(zhì)組成的線性真核染色體的末端結(jié)構(gòu),它具有預(yù)防末 端基因降解、染色體末端間的粘連和穩(wěn)定染色體末端及 其精確復(fù)制等功能.反向遺傳學(xué)(reverse genetics )：是從改變某個(gè)感興趣的基因或蛋白質(zhì)入手,然后去尋找相關(guān)的表型 變化.反轉(zhuǎn)座子(retroposon ) 或 "反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposo

7、n )":先轉(zhuǎn)錄為 RNA再反轉(zhuǎn)錄成 DNA 而進(jìn)行轉(zhuǎn)座的遺傳元件.核酶(ribozyme ):具有催化活性的 RNA,即化學(xué) 本質(zhì)是核糖核酸(RNA),卻具有酶的催化功能.核酶的 作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位.核心啟動(dòng)子(core promoter ):是指在體外測(cè)定 到的由RNA pol n進(jìn)行精確轉(zhuǎn)錄起始所要求的最低限度 的一套DNA序列元件.化學(xué)基因組學(xué)(chemogenomics):它是作為后基因 組時(shí)代的新技術(shù),是聯(lián)系基因組和新藥研究的橋梁和紐 帶.它指的是使用對(duì)確定的靶標(biāo)蛋白高度專一的小分子 化合物來(lái)進(jìn)行基因功能分析和發(fā)現(xiàn)新的藥物

8、先導(dǎo)化合 物.基因組印跡(genomic imprinting):也稱作基因印跡(gene impringting),是一種新發(fā)現(xiàn)的非孟德?tīng)栠z 傳現(xiàn)象,指來(lái)自雙親的某些等位基因在子代中呈現(xiàn)差異 性表達(dá)的現(xiàn)象.程序性細(xì)胞死亡/凋亡(programmed cell death/apoptosis):細(xì)胞應(yīng)答一類刺激劑,引起一連串 特征性的反響,從而啟動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的途經(jīng).焦磷酸化編輯(pyrophosphorolytic editing ):RNA聚合酶通過(guò)PPi的摻入(聚合反響的逆反響)去除 錯(cuò)誤參加的核昔酸,然后參加正常的核昔酸,雖然這種 編輯不能區(qū)分正常和錯(cuò)誤的核昔酸,但由于轉(zhuǎn)錄在錯(cuò)誤 參加

9、核昔酸后停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),而對(duì)其有優(yōu)先校正功能.酵母雙雜交(yeast two-hybrid):利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相 互作用.亮氨酸拉鏈(leucine zipper ):是由伸展的氨基 酸組成,每7個(gè)氨基酸中的第 7個(gè)氨基酸是亮氨酸,亮 氨酸是疏水性氨基酸,排列在 a -螺旋的一側(cè),所有帶 電荷的氨基酸殘基排在另一側(cè).當(dāng)2個(gè)蛋白質(zhì)分子平行排列時(shí),亮氨酸之間相互作用形成二聚體,形成“拉鏈.密碼子使用的偏好(relative synonymous codon usage, RSCU：編碼同一氨基酸的各個(gè)密碼子的使用頻 率在不同生物中并不相同,也不與該氨基酸在整個(gè)

10、蛋白 質(zhì)中的頻率成正比,這也就是密碼子使用的偏好現(xiàn)象, 該現(xiàn)象可影響基因表達(dá)的效率.母系印跡(maternal imprinting):來(lái)自母本的等位基因(母源等位基因)不表達(dá),而父源等位基因表達(dá) 的現(xiàn)象.母性基因(maternal gene):母體卵子發(fā)生時(shí)所 表達(dá)的基因,母性體細(xì)胞基因是在母性體細(xì)胞中表達(dá),而母性胚系基因那么在生殖細(xì)胞中表達(dá)(如卵母細(xì)胞).染色質(zhì)重塑(chromatin remodeling):是表觀遺傳修飾中一種常見(jiàn)的方式,是指導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞分裂周期 中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位置改變的過(guò)程.染色質(zhì)重塑因子(chromatin remodeling factor ): 依靠水解ATP提

11、供能量來(lái)完成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變.染色 質(zhì)重塑因子在組成及功能上不同,但都包含類Snf2超家族的ATP酶亞基增強(qiáng)子(enhancer):該DNA15列可增加與其連鎖 基因轉(zhuǎn)錄的頻率.增強(qiáng)子多位于基因的5'端,但也可位于基因的3'端,甚至基因的內(nèi)含子中.無(wú)位置及方 向性,但可能有組織細(xì)胞特異性,一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻 率增加10200倍,有的甚至可以高達(dá)上千倍.甚至遠(yuǎn) 離靶基因達(dá)幾千kb也仍有增強(qiáng)作用.轉(zhuǎn)座子沉默(transposon silencing ):宿主積累 了轉(zhuǎn)座子的多個(gè)拷貝,從而阻遏轉(zhuǎn)座發(fā)生.組成型剪接(constitutive splicing ):編碼蛋 白質(zhì)的不連續(xù)基

12、因通過(guò)RNA剪接將內(nèi)含子從 mRNA勺前體中依次去除,然后標(biāo)準(zhǔn)地將外顯子剪接成成熟的 mRNA這種剪接方式是一個(gè)基因只產(chǎn)生一種成熟的 mRNA 一般也只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物.組蛋白密碼(histone code )：組蛋白氨基端的各 種修飾(甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等)及組合 通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生效應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn) 而影響基因的表達(dá)活性,從而調(diào)控下游的細(xì)胞學(xué)過(guò)程.組蛋白修飾(histone modification) :是指染色 質(zhì)上的組蛋白被甲基化、乙酰化或磷酸化的過(guò)程.中央法那么(central dogma )于1958年提出的闡 明遺傳信息傳遞方向的法那么,指出遺傳信息從DN

13、A專遞至RNA再傳遞至多肽.DNA與RNA之間遺傳信息的傳遞是雙向的,而遺傳信息只是單向地從核酸流向蛋白 質(zhì).簡(jiǎn)做題：1. 核小體與核小體定位在基因表達(dá)及其調(diào)控中有何作用答：核小體的形成及其在染色質(zhì)上的精確定位導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不均勻,表現(xiàn)為某些區(qū)域核小體占據(jù)率高、某些區(qū)域核小體缺乏.由于核心DNA被包裝進(jìn)核小體中,阻斷了轉(zhuǎn)錄因子等與DNA的接觸時(shí)機(jī),核小體起基因轉(zhuǎn)錄抑制子的作用；而核小體之間的自由區(qū)域更有利于這些蛋白因子與其識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合；此外,核小體定位在染色質(zhì) 重塑過(guò)程中發(fā)生變化,從而明顯地影響基因的表達(dá)水平.2. 原核生物與真核生物的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)有什么差異答：原核生物的啟動(dòng)子特點(diǎn)： Prib

14、now框：TATAAT位于-10左右,是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn) Sextama框：TTGACA位于-35附近,是RNA聚合酶的初始結(jié)合位點(diǎn) 上述二者及之間的距離決定轉(zhuǎn)錄效率,一般距離17bp左右 CA咐點(diǎn)是cAMP-受體蛋白復(fù)合物在啟動(dòng)子上的的結(jié)合位點(diǎn)真核生物有三類 RN麻合酶,與此對(duì)應(yīng),有三類不同的啟動(dòng)子： RN麻合酶I識(shí)別的啟動(dòng)子,由起始位點(diǎn)的核心啟動(dòng)子和其上游限制元件兩局部組成.核心啟動(dòng)子包括-45到+20,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的啟始；上游限制元件從 -200到-150,它們之間的序列長(zhǎng)度對(duì)轉(zhuǎn)錄效率影響很大. RNAm合酶m啟動(dòng)子可分為兩種類型.一種是啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游,分為兩個(gè)亞型,I型

15、和n型,I型內(nèi)部啟動(dòng)子有兩個(gè)分開的序列boxA,和boxC,而它們之間的距離比較固定,為中間元件( internal element IE ),這是5SrRNA基因的 典型結(jié)構(gòu)；n型啟動(dòng)子內(nèi)部啟動(dòng)子由boxA和boxB組成,兩者之間距離較大,且不固定,是 tRNA基因啟動(dòng)子的典型結(jié)構(gòu).另一種啟動(dòng)子是與常見(jiàn)的啟動(dòng)子相似,又稱上游啟動(dòng)子( upstream promoter ).上游啟動(dòng)子包括三部分元件,即TATA匡,近側(cè)序列元件(proximal sequence element, PSE5 ,和遠(yuǎn)側(cè)序列元件 (distal sequence element, DSE ),這是局部snRNA基因

16、啟動(dòng)子的典型結(jié)構(gòu). RN麻合酶n啟動(dòng)子由四局部元件組成,即轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、TATA、上游元件和遠(yuǎn)上游元件.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(initiators )位于-3 +5,常和TATA盒組成核心啟動(dòng)子起始根底轉(zhuǎn)錄.絕大多數(shù)U型轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子均含有TATA盒,一致性序列為TATAAAA常在起始點(diǎn)上游-25bp - -30bp區(qū),TATA盒對(duì)有些n型轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的功能是十分重要.上游元件(upstream element,UE )位于TATA盒上游的元件種類較多,常見(jiàn)的有GC盒、CAAT含、八聚體元件、另外有些啟動(dòng)子還可見(jiàn)到KB ATFu等.GC盒：位于TATA±游特定位置上(-90bp ), 一個(gè)或幾個(gè)含

17、有高GC序列的元件,有位置依賴性,但無(wú)方向依賴性,它與SP1蛋白結(jié)合后可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的效率.CAAT盒一般位于起始點(diǎn)上游-80到-75左右.可極大的提升轉(zhuǎn)錄的效率,但對(duì)其起點(diǎn)、特異性等無(wú)影響.遠(yuǎn)上游元件或遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū),比較常見(jiàn)的有增強(qiáng)子、沉默子、上游激活序列、邊際序列、絕緣子等.3. 常見(jiàn)的反式作用因子有哪些其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么答：轉(zhuǎn)錄因子有數(shù)千種之多,從其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看,主要有兩大功能區(qū),DNA吉合域,活性域.對(duì)于 DNA結(jié)合域,根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn),又可分為：螺旋 -轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix,HTH ),鋅指(zinc finger ),螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-

18、helix,HLH ),亮氨酸拉鏈(leucine zipper , ZIP),同源異型域(homeodomain,HD),激素受體類(類固醇等)或核受體類,3 桶(3 -barrels )結(jié)構(gòu)等.大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí) 這兩大功能域是分開的,但不同轉(zhuǎn)錄因子的活性域其激活方式可能不同. 鋅指蛋白,鋅指結(jié)構(gòu)域是由蛋白質(zhì)上保守的半胱氨酸及/或組氨酸與鋅原子結(jié)合形成一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu).典型的鋅指蛋白往往有多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)鋅指之間由7?8個(gè)氨基酸相連.從每個(gè)鋅指的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看,其N端形成3折疊,C端形成a螺旋.反向平行的3折疊區(qū)含有2個(gè)半胱氨酸,與其后 a螺旋中的2個(gè)組氨酸一起與鋅原子結(jié)合,而由鋅原子穩(wěn)定了

19、整個(gè)鋅指結(jié)構(gòu). 同源異型域蛋白,同源異型域(homeodomains,HD)蛋白含有60個(gè)氨基酸保守序列的DNA吉合蛋白,屬于HTH蛋白,可形成三個(gè)螺旋區(qū),其中螺旋 2、螺旋3形成典型的HT或,螺旋3識(shí)別螺旋與DNA溝 結(jié)合,其N末端臂參與DNA/J、溝的結(jié)合3 -barrels 結(jié)構(gòu)域,由多個(gè)反向平行的 3折疊構(gòu)成的3 -桶(3 -barrels) 結(jié)構(gòu),每個(gè)亞基上的也-螺旋那么與DN飲溝相結(jié)合,兩個(gè)相鄰的大溝被識(shí)別螺旋結(jié)合后可導(dǎo)致DN"子發(fā)生45.的彎曲. 螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域,長(zhǎng)4050個(gè)氨基酸,有兩個(gè)長(zhǎng) 1516個(gè)氨基酸的親水、親脂的 a螺旋,長(zhǎng)度不同的環(huán)(連接區(qū))將其分開.

20、多數(shù)HLH附近有一強(qiáng)堿性的氨基酸區(qū)是DNA勺識(shí)別和結(jié)合所必需的亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)域,亮氨酸拉鏈(leucine zipper , ZIP)的雙親a螺旋其疏水面亮氨酸突出,并與 另一個(gè)平行的亮氨酸拉鏈蛋白的亮氨酸突出交錯(cuò)排列,盤繞成卷,兩個(gè)右手螺旋互相纏繞,每圈個(gè)氨基 酸,每7個(gè)殘基構(gòu)成一個(gè)完整的重復(fù)單位,因此亮氨酸在拉鏈區(qū)每隔6個(gè)氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)一次,兩個(gè)蛋白形成同源二聚體或異源二聚體.在每個(gè)拉鏈蛋白質(zhì)中與亮氨酸重復(fù)序列鄰近的區(qū)域是高度堿性 的,可作為一個(gè) DN廂勺結(jié)合位點(diǎn).整個(gè)二聚體呈Y型結(jié)構(gòu).4. 原核生物與真核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的主要差異是什么 在原核生物中,基因表達(dá)的調(diào)控以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)

21、控為主,在調(diào)節(jié)基因的作用下,主要以操縱子為單位,轉(zhuǎn)錄出一條多順?lè)醋?mRNA并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成；而且轉(zhuǎn)錄和譯是偶聯(lián)的,很少發(fā)生mRNA勺加工、修飾.但也存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,例如反義RNA的調(diào)控,譯的調(diào)控,RNA開關(guān)等. 在真核生物中,基因表達(dá)的調(diào)控十分復(fù)雜,可發(fā)生在多個(gè)層次、多個(gè)水平,包括從染色體和染色質(zhì)的表觀 遺傳學(xué)限制,DNA勺復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄、加工與拼接、蛋白質(zhì)譯及譯后加工、修飾等等.對(duì)于真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,主要是順式作用元件( cis-acting element )與反式作用因子(trans-acting factor) 的 相互作用. 另外,DNA的重排和RNA勺交替剪接也是

22、真核生物基因表達(dá)多樣性的重要機(jī)制；近年發(fā)現(xiàn)的小分子 RNA®過(guò)RN"擾途徑也可調(diào)節(jié)基因的表達(dá),介導(dǎo)DNA的甲基化、mRNA勺降解及譯起始的抑制等.5. 轉(zhuǎn)座子的遺傳學(xué)效應(yīng)與應(yīng)用答： 改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu),引起的染色體DNA缺失或倒位；誘發(fā)基因突變； 調(diào)節(jié)基因表達(dá),很多轉(zhuǎn)座子帶有增強(qiáng)子,有的還含有啟動(dòng)子,能促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄活性；轉(zhuǎn)座子插入 某個(gè)基因的內(nèi)含子或外顯子中而影響該基因表達(dá)； 產(chǎn)生新的變異； 應(yīng)用轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù),克隆目的基因； 以轉(zhuǎn)座因子作為基因工程載體,進(jìn)行轉(zhuǎn)基因等遺傳操作.6. 簡(jiǎn)述染色質(zhì)重塑的根本過(guò)程及其生物學(xué)功能.答：染色質(zhì)重塑是指導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞分裂周期中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和位

23、置改變的過(guò)程.此過(guò)程由兩種蛋白復(fù)合體所介導(dǎo),即ATP依賴型核小體重構(gòu)復(fù)合體和組蛋白修飾復(fù)合體.染色質(zhì)的重塑因子通過(guò)利用ATP水解釋放的能量,引起特定核小體位置的改變(滑動(dòng)),或核小體三維結(jié)構(gòu)的改變,或二者兼有,將核小體重新排布,從高度致密的染色質(zhì)上解開,從而使啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件得以暴露,為反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)與之結(jié)合提供了空間接觸的可能.組蛋白修飾因子并不改變核小體的位置,而是在DNA±作標(biāo)記,以招募其他的活性成分 (組蛋白密碼),對(duì)核心組蛋白N端尾部進(jìn)行共價(jià)修飾,從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu).染色質(zhì)重塑是DNA賢復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié).細(xì)胞基因組中的DNA!常并非處于

24、裸露狀態(tài),而是與組蛋白一起構(gòu)成結(jié)構(gòu)致密的染色質(zhì),故染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變會(huì)影響基因的表達(dá).細(xì)胞中存在著各種不 同的染色質(zhì)重塑因子復(fù)合物激活或者沉默基因的表達(dá).染色質(zhì)重塑在個(gè)體發(fā)育,人類疾病及基因劑量補(bǔ)償中具有重要作用 論述題1. 有哪些方法可用于功能基因組學(xué)的研究現(xiàn)在有何進(jìn)展答：隨著多種生物全基因組序列的獲得,基因組研究正在從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)的整體研究.在功能基因組學(xué)的研究中通常運(yùn)用高通量技術(shù)(high-throuput techniques ),如DNA微陣列(DNAmicroarrays ),反向遺傳學(xué)(reverse genetics )技術(shù)如基因打靶,轉(zhuǎn)基因以及反義mRN呼日

25、RNA干擾等技術(shù)來(lái)系統(tǒng)地分析基因功能及基因間相互作用,基因組的時(shí)空表達(dá)以及發(fā)現(xiàn)和尋找新基因等.(1) DNA微陣列技術(shù)又稱 DNA芯片(DNA chips )或基因芯片技術(shù)( gene chips ),它通過(guò)將對(duì)應(yīng)于不 同基因或cDNA的DNA片段或寡聚核昔酸點(diǎn)樣于微芯片上形成高密度的矩陣,與熒光標(biāo)記的總mRNAS行雜交,然后通過(guò)激光共聚焦掃描檢測(cè)并運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行自動(dòng)化定性定量分析,具有高通量、實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn).(2) 基因打靶是指通過(guò)轉(zhuǎn)染的DNA序列與細(xì)胞內(nèi)同源的基因組序列(靶序列)之間進(jìn)行同源重組,以改變靶序列來(lái)研究其結(jié)構(gòu)和功能或進(jìn)行基因治療的技術(shù).基因打靶技術(shù)包括基因

26、敲除(knock-out )和基因敲入(knock-in),前者是用無(wú)功能的DNA序列與靶序列重組,破壞原基因組的遺傳功能,后者是用有功能的 DNA序列與受到破壞的靶序列重組使其恢復(fù)遺傳功能.基因打靶技術(shù)是一種從基因到表型 的新研究方法,屬于反求遺傳學(xué)范疇.(3) 反義 mRN破術(shù)通過(guò)向細(xì)胞導(dǎo)入一段與特定編碼mRNAK補(bǔ)的非編碼 RNA鏈,使其與該段mRNA寺異性結(jié)合而定向阻抑靶基因表達(dá)的技術(shù).這一技術(shù)的成熟,為功能基因組學(xué)的研究和基因治療提供了新的思路.在反義 mRN破術(shù)的研究過(guò)程中,科學(xué)家們意外發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入正義mRNA( sense RNA)與導(dǎo)入反義mRN如有等效的阻抑效應(yīng).而更令人吃驚的是

27、如果導(dǎo)入相應(yīng)雙鏈RNA(dsRN3,其阻抑效應(yīng)比導(dǎo)入任一單鏈RNA強(qiáng)十倍以上,dsRNA假設(shè)經(jīng)純化那么阻抑效應(yīng)更強(qiáng).這種雙鏈RNA特異性地作用于與其序列配對(duì)的基因而抑制其表達(dá)的現(xiàn)象叫做RNA干預(yù).RNA干預(yù)技術(shù)作為一種新的定點(diǎn)敲除knockdown技術(shù),賦與了功能基因組學(xué)、基因治療等全新的思路,堪稱生命科學(xué)近年來(lái)的革命性的突破.因而發(fā)現(xiàn)RNA干擾機(jī)制的兩位美國(guó)科學(xué)家Fire和Mello榮獲2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).可見(jiàn)該項(xiàng)成果的重大科學(xué)意義.2. 目前最常用的突變體創(chuàng)制方法有哪些如何利用突變體進(jìn)行功能基因組學(xué)研究答：1.化學(xué)誘變,化學(xué)誘變劑主要有烷化劑、堿基類似物、亞硝基化合物、疊氮化物

28、等,多用烷化劑, 如EMS MNUo EM溯發(fā)的特點(diǎn)是突變均勻分布于整個(gè)基因組中而不呈現(xiàn)明顯的“熱點(diǎn).我們不僅僅可以通過(guò)EM涎成轉(zhuǎn)錄提前終止的功能缺失突變體來(lái)研究基因的功能,也可以通過(guò)錯(cuò)義突變引起的一些表型較弱、中間類型的突變體來(lái)研究功能蛋白中某個(gè)特定氨基酸殘基的功能.2. 物理誘變,誘變劑主要有紫外線,X-射線,丫 -射線,快中子,激光,微波,離子束等；電離輻 射廣泛用于植物、動(dòng)物和微生物的誘變育種,由于快中子具有能量高、輻射處理的劑量容易限制和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),在生物誘變上具有獨(dú)到的優(yōu)點(diǎn)：如對(duì)子粒較大的玉米、大豆等的誘變效率較高,誘變的劑量(強(qiáng)度和時(shí)間)容易限制,在一個(gè)基因組上可以存在多個(gè)突

29、變位點(diǎn),同時(shí)誘變后生物材料仍保持較高的活性3. 生物技術(shù),轉(zhuǎn)基因,基因打靶,激活標(biāo)簽法,Gatew ay全長(zhǎng)cDNA過(guò)量表達(dá)技術(shù)和 RN"涉技術(shù)等.T-DNA標(biāo)簽技術(shù)是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化為根底的一種插入突變研究方法,在獲得穩(wěn)定的突變表型后可用報(bào)告基由于探針在突變體文庫(kù)中克隆相應(yīng)的功能基因.還可通過(guò)質(zhì)粒挽救的方法克隆插入序列兩翼的 基因片段.T-DNA標(biāo)簽突變體庫(kù)除了通過(guò)基因敲除來(lái)研究基因功能以外,還可通過(guò)對(duì)T-DNA標(biāo)簽的改造建立了激活標(biāo)簽(activation tagging )突變體庫(kù),和捕獲標(biāo)簽(entrapment tagging )突變體庫(kù). 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)：廣泛應(yīng)用于

30、病毒、細(xì)菌、酵母、果蠅、擬南芥菜、水稻等物種的突變體創(chuàng)制與基因功能研究.尤其是在高等植物上取得了突破性進(jìn)展,如玉米激活子(activator , Ac)、解離子 (dissociation , Ds)、增變子(mutator , Mu)、金魚草 Tam 矮牽牛 dTphl 以及水稻的 Tos17.構(gòu)建突變體庫(kù)是功能基因組學(xué)研究的重要手段.1. 重要性狀基因的克隆與鑒定：通過(guò)TILLING、PC& walking 或圖位克隆技術(shù),可以獲得某些突變性狀所對(duì)應(yīng)的突變基因,確定基因與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系.只要擁有飽和的突變體庫(kù),理論上可以獲得所有基因的突變體.2. 創(chuàng)制中間材料,研究生物生長(zhǎng)發(fā)育和代

31、謝途徑3. RNAi通過(guò)哪些機(jī)制限制基因的表達(dá)實(shí)踐中有何應(yīng)用答：RNA 干預(yù)(RNA interference, RNAi)通過(guò)雙鏈 RNA( double-stranded RNA, dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默.它可以快速分析靶基因的功能,成為反向遺傳學(xué)研究的重要工具之一.1) 胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶 Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(約2123 bp ),即siRNA.siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA軍旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RN砌導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silen

32、cing complex , RISC).RISC與外源性基因表達(dá)的 mRNA勺同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合, RISC具有核酸酶的功能,在結(jié)合部位切割 mRNA 切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端.被切割后的斷裂mRN眥即降解,從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì) 這些mRNA勺降解反響.siRNA不僅能引導(dǎo) RISC切割同源單鏈 mRNA而且可作為引物與靶 RNA吉合并在RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase , RdRP*乍用下合成更多新的 dsRNA 新合成的 dsRNA再由Dicer 切割產(chǎn)生大量的次級(jí) siRNA,從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大,最終將靶mRN

33、AS全降解,使基因沉默2) 線蟲的lin4和let7,通過(guò)和靶基因 mMT的3'末端非譯區(qū)結(jié)合而阻斷相應(yīng)蛋白質(zhì)的譯3) RNAi對(duì)基因表達(dá)的靜默作用可能通過(guò)染色質(zhì)濃縮實(shí)現(xiàn),dsRNA可結(jié)合到植物啟動(dòng)子區(qū)域,能通過(guò)一種使DNA甲基化的作用導(dǎo)致基因沉默.4) siRNA可能參與纖毛蟲,四膜蟲蟲體間結(jié)合時(shí)的基因重組.在蟲體之間結(jié)合過(guò)程中,結(jié)合到重組序列的 siRNA介導(dǎo)DNA缺失和染色體斷裂.5) 轉(zhuǎn)座子沉默與siRNA有關(guān),蠕蟲mut-7 基因參與RNAi和轉(zhuǎn)位抑制,從裂殖酵母的中央粒區(qū)別離出 siRNA,并檢測(cè)到這些 siRNA介導(dǎo)此區(qū)內(nèi)組蛋白甲基化.應(yīng)用：1) RNAi在探索基因功能中

34、的應(yīng)用在RNAi技術(shù)出現(xiàn)以前,基因敲除( gene knockout )是主要的反向遺傳學(xué)( reverse genetics )研究手段,但其技術(shù)難度較高、操作復(fù)雜、周期長(zhǎng).由于RNAi技術(shù)可以利用 siRNA或siRNA表達(dá)載體快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的以序列特異方式剔除目的基因表達(dá),所以現(xiàn)在已經(jīng)成為探索基因功能的重要研究手段.同時(shí)siRNA表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建方法的建立,使得利用 RNAi技術(shù)進(jìn)行高通量篩選成為可能,對(duì)說(shuō)明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)有重要意義.2) RNAi在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用RNAi的作用具有高效率和高特異性的特點(diǎn),它能使目標(biāo)蛋白的mRN成生特異性降解.因此 RNAi是基因沉

35、默療法的理想工具.目前,人們已經(jīng)證實(shí)在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,可用于抗病毒和抗 腫瘤等的基因治療；3) 其他a) RNAi在新藥物的研究與開發(fā)中的應(yīng)用可以作為高通量藥物靶標(biāo)靶標(biāo)識(shí)別和確認(rèn)的工具；b) 由于能高效特異的阻斷基因的表達(dá),可使其成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具；c) RNAi技術(shù)已被用于改良植物品質(zhì)、改善植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面的研究,取得了客觀的經(jīng)濟(jì)效益.4. DNA甲基化是如何在轉(zhuǎn)錄水平上抑制基因表達(dá)的 直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與各自啟動(dòng)子結(jié)合的識(shí)別位置DNA的大溝是許多蛋白因子與 DNA吉合的部位,胞嚅嚏的甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA勺結(jié)合.許多轉(zhuǎn)錄因子,如 AP-2和E2F等能識(shí)別含CpG的

36、序列,且對(duì)其甲基化程度非常敏感,當(dāng) CpG上的C被甲基化后,轉(zhuǎn)錄即被抑制. 轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物干擾基因轉(zhuǎn)錄甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的甲基化CpG島結(jié)合,再與其它一些蛋白共同形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物 (transcriptional repression complex, TRC),阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)靶序列的結(jié)合,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄.已經(jīng)鑒定了甲基化胞.密嚏結(jié)合蛋白1和2(MeCP 1和MeCP2及甲基化DNA結(jié)合蛋白(MBD等轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物.MeCP1的抑制作用比較弱,需要與含12個(gè)甲基化CpG的位點(diǎn)結(jié)合,缺乏MeCP1的細(xì)胞其基因組內(nèi)甲基化基因的抑制作用減弱.MeCP難細(xì)胞中比MeCPl豐

37、富,轉(zhuǎn)錄抑制作用比較強(qiáng),可與單個(gè)甲基化的 CpG堿基對(duì)結(jié)合. 通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)而抑制基因表達(dá)DNA甲基化與組蛋白去乙?；嚓P(guān),而乙?；揎椪钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)的另一重要方式.染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨著組氨酸的乙?；腿ヒ阴；?許多乙酰化和去乙?；副旧?就分別是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子蛋白和轉(zhuǎn)錄阻遏物蛋白.DNA失活的區(qū)域處于高度甲基化狀態(tài),同時(shí)又富含低乙酰化組氨酸.CpG二聚體中胞嚅嚏甲基化是高等真核生物基因組的主要特征.一般來(lái)說(shuō),在基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化伴隨著基因沉默.5. 真核生物CG島的甲基化狀態(tài)與基因的表達(dá)活性的關(guān)系如何 CpG島經(jīng)常出現(xiàn)在真核生物的house-keeping 基因的5'端

38、調(diào)控區(qū)域調(diào)控區(qū),在其它地方出現(xiàn)時(shí)會(huì)由于CpG中的C易被甲基化而形成 5'-甲基胞嚅嚏,脫氨基后形成胸腺嚅嚏,由于T本身就會(huì)存在于 DNA中,因此不易被修復(fù),所以被淘汰.故CpG在基因組中是以島的形式分布的. 除定位于失活 X染色體上的基因和印跡基因外,正常細(xì)胞的CpG島由于被保護(hù)而處于非甲基化狀態(tài).啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的非甲基化狀態(tài)對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是必須的,而甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián),去甲基化 往往與一個(gè)沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián). 目前認(rèn)為基因調(diào)控元件如啟動(dòng)子的CpG島中發(fā)生5mC修飾會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合,而直接抑制基因表達(dá)；通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),

39、間接影響基因表達(dá) 全基因組低甲基化,維持甲基化模式酶的調(diào)節(jié)失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象.以往的研究證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是人類腫瘤所具有的共同特征之一,而且這種高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一個(gè)機(jī)制.6. 端粒及其生物學(xué)意義它具有預(yù)防末端基因降解、染RNA和蛋白質(zhì)組成,是對(duì)于正常細(xì)胞來(lái)說(shuō),當(dāng)進(jìn)行了端粒是由許多簡(jiǎn)單重復(fù)序列和相關(guān)蛋白組成的線性真核染色體的末端結(jié)構(gòu), 色體末端間的粘連和穩(wěn)定染色體末端及其精確復(fù)制等功能.端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,由 以自身RNA為模板,合成端粒重復(fù)序列,加到新合成DNA鏈末端. 端粒與衰老：大量實(shí)驗(yàn)說(shuō)明端粒、端粒酶活性與

40、細(xì)胞衰老有著一定的聯(lián)系一定次數(shù)的分裂后,端粒長(zhǎng)度縮短到一定程度,會(huì)使細(xì)胞停止分裂,導(dǎo)致衰老與死亡；有很多與老年相關(guān) 的疾病以及早衰綜合癥都與端粒加快縮短相關(guān)；此外,端粒酶基因的突變體還會(huì)引起很多人類的一些綜合 癥,如再生障礙性貧血. 端粒與癌癥：90%上的癌細(xì)胞都通過(guò)端粒酶途徑來(lái)維持端粒長(zhǎng)度, 通過(guò)抑制端粒酶的活性來(lái)阻止癌細(xì)胞生 長(zhǎng)一直是人們治療癌癥的一個(gè)策略. 端粒與干細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度能調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新的水平和腫瘤的抑制的平衡狀態(tài).但是許多問(wèn)題用端粒學(xué)說(shuō)還不能解釋.研究發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)期維持在一個(gè)較高的水平,而端粒酶卻不表達(dá).另外,Kippling 發(fā)現(xiàn),鼠的端粒比人類長(zhǎng)近5-10倍,

41、壽命卻比人類短的多.這些都提示體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度與個(gè)體的壽命及不同組織器官的預(yù)期壽命并非一致.生殖細(xì)胞的端粒酶活性長(zhǎng)期維持較高的水平卻不會(huì)象腫瘤那樣無(wú)限制分裂繁殖；生殖細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性較高,體細(xì)胞中為什么沒(méi)有較高的端粒酶活性.看來(lái)端 粒的長(zhǎng)度縮短是衰老的原因還是結(jié)果尚需進(jìn)一步研究.7. 組蛋白修飾與基因表達(dá)調(diào)控組蛋白H2A、H2B H3和H4是核心組蛋白,只有當(dāng)DNA存在時(shí)它們才能組裝成一種有序的結(jié)構(gòu).組蛋白N端尾的修飾也可以改變?nèi)旧|(zhì)的易接近性而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性.組蛋白N端尾部可被多種酶修飾,不同組蛋白末端修飾的方式不同,這些修飾包括：乙?；⒘姿峄?、甲基化、泛素化、ADP糖基化等.不同修飾的

42、組合與基因的表達(dá)狀況密切相關(guān),又稱組蛋白密碼.這主要是由于修飾的核小體蛋白 改變了與其 DNA的結(jié)合狀態(tài),使有些位點(diǎn)暴露,或可與其它基因表達(dá)調(diào)控蛋白結(jié)合,改變基因表達(dá)狀O核心組蛋白都可以被乙?；?主要的乙酰化位點(diǎn)在組蛋白H3、H4的N端尾部的賴氨酸.乙酰化在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生.在復(fù)制時(shí),組蛋白的乙?；苡斜匾?這使得它們更容易被整合到新的核心；在轉(zhuǎn)錄中,乙?；瘜?duì)于相關(guān)結(jié)構(gòu)上的變化也很有必要,甚至可能允許組蛋白核心從DNA上去除,或者可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄必需的其他蛋白的結(jié)合位點(diǎn).在進(jìn)行有絲分裂的染色體中,經(jīng)常可以觀察到高度壓縮的染色質(zhì)上組蛋白 H3 N端尾部被磷酸化.據(jù)推測(cè),這些修飾可能被參與基因表

43、達(dá)和其他DNA行為的蛋白質(zhì)所識(shí)別.組蛋白 N端的修飾改變了染色質(zhì)的功能,從而影響到基因的表達(dá)和調(diào)控.8. 論述基因編輯技術(shù),重點(diǎn)說(shuō) crisper .基因編輯是近年來(lái)開展起來(lái)的可以對(duì)基因組完成精確修飾的一種技術(shù),可完成基因定點(diǎn)InDel突變、敲入、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的刪失等,可在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯.在科研領(lǐng)域, 該技術(shù)可以快速構(gòu)建模式動(dòng)物,節(jié)約大量科研時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,該技術(shù)可以人為改造基因序 列,使之符合人們的要求,如改良水稻等糧食作物；在醫(yī)遼領(lǐng)域,基因編輯技術(shù)可以更加準(zhǔn)確、深入 地了解疾病發(fā)病機(jī)理和探究基因功能,可以改造人的基因,到達(dá)基因治療的目的等.因此,基因組編

44、輯具有極其廣泛的開展前景和應(yīng)用價(jià)值.?ZFN TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因編輯技術(shù)1) ZFN?的基因打靶效率能夠到達(dá)30%左右,已經(jīng)可以做到針對(duì)某些特定的序列來(lái)設(shè)計(jì) ZFN實(shí)現(xiàn)靶基因的修飾,但也有其開展的局限性, ZFN?勺識(shí)別結(jié)構(gòu)域中存在上下文依賴效應(yīng),使得ZFN設(shè)計(jì)和篩選效率大大降低,也無(wú)法實(shí)現(xiàn)在每一個(gè)基因或其他功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點(diǎn).另外,由于 ZFN的脫靶切割會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性,使得其在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用出現(xiàn)了一定的局限 性.2) 相比ZFN技術(shù),TALEN楸用了 TALE?分子代替?ZF?作為人工核酸酶的識(shí)別結(jié)構(gòu)域,極好地解決了 ZFN對(duì)于D

45、NA療列識(shí)別特異性低的問(wèn)題.TALE蛋白與DNA堿基是對(duì)應(yīng)的,并且對(duì)堿基的識(shí)別只由2?個(gè)氨基酸殘基決定,這相對(duì)于ZFN的設(shè)計(jì)要簡(jiǎn)單得多.但是在構(gòu)建過(guò)程中,TALE?分子的模塊組裝和篩選過(guò)程比較繁雜,需要大量的測(cè)序工作,對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低,而商業(yè)化公司構(gòu) 建也需要花費(fèi)上千美元,使用本錢較高；3) 相較于?ZFn?和?TALENM種人工核酸酶技術(shù),CRISPR/Cas9?系統(tǒng)是一個(gè)天然存在的原核生物RNA干擾系統(tǒng),其介導(dǎo)的基因組編輯是由crRNA?指導(dǎo)的,對(duì)靶序列的識(shí)別是 RNA方DNA?勺堿基配對(duì)過(guò)程,相比蛋白質(zhì)對(duì)DNA療列的識(shí)別要精確更多,降低了脫靶切割的幾率,減低了細(xì)胞毒性.而且C

46、RISPR/Cas9?的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計(jì)與靶序列互補(bǔ)的RNA削可,過(guò)程相對(duì)于 TALEN瓶為簡(jiǎn)單和廉價(jià),普通的實(shí)驗(yàn)室也可以自行完成構(gòu)建,這大大提升了基因操作的效率及簡(jiǎn)便性.但是,CRISPR/Cas9?系統(tǒng)也存在著一些缺乏.首先,Cas9?蛋白對(duì)于目標(biāo)序列的切割不僅僅依靠?crRNA?序列的匹配,在目標(biāo)序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM),如果目標(biāo)序列周圍不存在PAM或者無(wú)法嚴(yán)格配對(duì),貝U ?Cas9?蛋白不能對(duì)任意序列進(jìn)行切害IJ.最后,和ZFN?及TALEN彼術(shù)一樣,CRISPR/Cas9?也面臨著如何限制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復(fù)可能隨機(jī)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問(wèn)題.9. 測(cè)

47、序技術(shù)的開展及應(yīng)用9.測(cè)序技術(shù)的開展及應(yīng)用早期測(cè)序技術(shù)：1954年,Whitfeld 等用化學(xué)降解的方法測(cè)定多聚核糖核昔酸序列.第一代測(cè)序技術(shù)：1977年,Sanger等創(chuàng)造雙脫氧核昔酸末端終止法和Gilbert 等創(chuàng)造化學(xué)降解法,標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生.第一代測(cè)序技術(shù)完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作,但存在本錢高、速度慢等方面的缺乏.第二代測(cè)序技術(shù)：21世紀(jì)后,以 Roche公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生.第二代測(cè)序技術(shù)較第一代測(cè)序技術(shù)有采用矩陣分析技術(shù),實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模并行化,使得矩陣上的DNA樣本可以被同時(shí)并行分析；邊測(cè)序

48、邊合成,測(cè)序速度大大提升；測(cè)序儀微型化,測(cè)序成本大大降低的特點(diǎn).缺點(diǎn)：產(chǎn)生的測(cè)序結(jié)果長(zhǎng)度比較短,適用于對(duì)序列的基因組進(jìn)行重新測(cè)序,且對(duì)全新的基因組進(jìn)行測(cè)序時(shí)還需結(jié)合第一代測(cè)序技術(shù).第二代測(cè)序技術(shù)原理是建立在PCR的根底上,但是擴(kuò)增后得到的DNA分子片段的數(shù)目和擴(kuò)增前DNA分子片段的數(shù)目比例有相對(duì)偏差,在分析基因表達(dá)方面存在較大的弊端.簡(jiǎn)而言之,缺點(diǎn)是序列讀長(zhǎng)較短和需要模板擴(kuò)增步驟第三代測(cè)序技術(shù)：技術(shù)標(biāo)志是單分子測(cè)序和長(zhǎng)讀長(zhǎng).第三代測(cè)序技術(shù)通過(guò)在單一DNA分子組成的陣列上進(jìn)行合成測(cè)序.在一個(gè)外表積限定的介質(zhì)上使用單個(gè)分子,可以增加獨(dú)立分析的DNA片段的數(shù)量,也意味著不再進(jìn)行昂貴的DNA擴(kuò)增步驟了

49、,因此,可以使數(shù)據(jù)產(chǎn)出量更高,并且將進(jìn)一步降低測(cè)序的本錢.主要問(wèn)題：集中在單分子水平光學(xué)信號(hào)的檢測(cè)方面,準(zhǔn)確性降低.第四代測(cè)序技術(shù)：代表為納米孔測(cè)序,它不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何生物或化學(xué)方面的處理,而采用物理方法直接讀出其堿基序列.原理為：?jiǎn)蝹€(gè)堿基通過(guò)納米孔通道時(shí),就會(huì)引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化, 并且由于ATGC這4種不同的堿基存在電學(xué)性質(zhì)差異,使得它們穿越納米孔時(shí)所引起的電學(xué)參數(shù)的變化量也不同.因此,不同的電學(xué)參數(shù)變化量就對(duì)應(yīng)通過(guò)納米孔的相應(yīng)堿基.參見(jiàn) 新一代測(cè)序技術(shù)的開展和應(yīng)用.田李等名詞解釋十選八論述2個(gè)簡(jiǎn)答3-4個(gè),重點(diǎn)看下第 3、5個(gè)表1.分子造傳學(xué)相關(guān)坂秘貝爾獎(jiǎng)名錄姓名獲獎(jiǎng)國(guó)箝功績(jī)

50、時(shí)間Landsteiner. K1930美人類血型的發(fā)現(xiàn)MoraiuT.H1933美連皴定律和遺隹的染色佛學(xué)說(shuō)Mnlkr.HL1946美X朗線訝導(dǎo)基因美爽W后 ntum,E L1O5X羊“一個(gè)基因一個(gè)陶學(xué)說(shuō)Lodoitoig,J.1952美細(xì)苗雜交的方法并發(fā)現(xiàn)祛 導(dǎo)作用Saxigci.F1958美蛋白質(zhì)的一頒姑構(gòu)Dcho&,S. <fc Kombeigq.1959美RNA泉合B5與DNA隸臺(tái)酶IBunt et ,F .M.F&JVtedavar F.BI960美抗秒7V成中克隆選捽學(xué)說(shuō)Calvin.M1961美光和作片中的CO 同1化作用的生化機(jī)制W&tsonJ.

51、D& CricKF.H.C.1962美建立DNK的雙螺旋模型Wilkins,MH.F.1962英DNA雙螺旋模型的X射線衍射國(guó)Eccles J.C., Hodgkin AL.,1963澳大利神經(jīng)膜電位的發(fā)現(xiàn)&HuxleyA.F亞,英Jacob,Monod,J .L.1965法乳愿噪縱子模型L5,A,M1965法涪原現(xiàn)象的機(jī)制Rou&F.P.1966美鳥類中的致癌病毒Borlaug,N.1967墨西哥墨西哥超級(jí)小麥品種HoUeyR.W.1968美苯丙氨酸t(yī)RNA的序列、結(jié)構(gòu)和反密碼子Nirenhe宅,M.W. & KhoranH.G.1968美造住密碼的破譯H ersheg A.D ,