His-Tag表達(dá)蛋白純化原理方法和問題分析

1、組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化His-Tag 融合蛋白是目前最常見的表達(dá)方式，而且很成熟，它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)方便 而且基本不影響蛋白的活性， 無論是表達(dá)的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用chromatography) 是 Porath et 年 鎳、鈷或鋅離子， 可以吸附純化表 1987 年 Smith et al. 發(fā)現(xiàn)帶有幾固定金屬離子親和色譜去(IMAC純化。21 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity用固定IDA作為配基的填料螯合過渡金屬銅、面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白， 個(gè)組氨酸或色氨酸小肽和螯合金屬離子的IDA-sephadex G-25作用力更強(qiáng)，此前

2、在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25親和純化在氨基端帶組氨酸和色氨酸的胰島素原。同年1987年Hochuli et al.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更強(qiáng)于普通的肽，1988年他第一次用這樣的方法純化 了帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的多肽， 無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到 很好效果，此后表達(dá)帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對(duì)而言，不帶標(biāo)簽的蛋白純化就非常困難，所以表達(dá)帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有力手段。1986年P(guān)orath et al.還發(fā)現(xiàn)Fe3+-IDA-

3、sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的純化，而 后發(fā)現(xiàn)Ga3+-IDA也有同樣的效果，這樣螯合這兩種金屬離子的填料就有效用于 磷酸化多肽的富集和純化，同時(shí)IMAC也可以用于純化各種和金屬離子結(jié)合的多 肽，應(yīng)用非常廣泛。市面常見的商品化IMAC用于帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽蛋白的配基有以下幾種：影響IMAC純化結(jié)果的因素：2.2.1 填料的種類：不同填料廠家的填料有差別， 所以使用過程最好能得到廠家的技術(shù)支持， 因?yàn)椴?同的廠家填料不同， 此外蛋白純化個(gè)性很強(qiáng)， 沒有哪一個(gè)填料是能適合所有帶六 個(gè)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，載量高和特異性好本身就是矛盾。填料的配基種類、密度、金屬離子種類填料最簡(jiǎn)單的判斷

4、是螯合好同樣的金屬離子， 哪家產(chǎn)品的顏色越深就意味著和蛋 白的作用力越強(qiáng)，適用范圍越廣，載量也越高，純化的好壞關(guān)鍵看純化的條件， 僅有填料的特異性是不夠的，同樣配基密度下 IDA填料的親和力要比NTA的強(qiáng)， 所以NTA上不能吸附的樣品可以選擇IDA為配基的填料。螯合金屬離子和蛋白作用強(qiáng)弱為銅和鎳離子的強(qiáng)，而鋅和鉆離子的弱。因此如果 一個(gè)蛋白作用力強(qiáng)，想得到好的特異性可以選擇螯合鉆離子， 它還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是 不怕還原劑，特別時(shí)候有高濃度的還原劑。相同金屬離子，IDA的強(qiáng)于NTA螯合金屬離子的價(jià)位越低和蛋白的作用力越強(qiáng)。同時(shí)鎳離子是最常用的，如果有條件可以換不同金屬離子以得到更好的效果，因?yàn)椴煌慕?/p>

5、屬離子有不同的選擇 性。因此要希望填料應(yīng)用范圍廣就選擇鎳瓊脂糖凝膠，如果是希望特異性好而且 穩(wěn)定就選擇鎳NTA瓊脂糖凝膠.整合金屬離嚴(yán)的配菇1幕介儉居離子的價(jià)荷和尿簽侍合位點(diǎn)IDA3NIA42dp4寸TED51可選樣灼純化填料:填料名稱配基配嗚密度練瓊脂糖農(nóng)膠FFmA約 4Oiiniol nil平壊1山gink用大*WJI膠 FFNTA20 iunol/ml平於j別lOmgnl2.2.2蛋白本身的結(jié)構(gòu)和樣品來源IMAC原理已經(jīng)說明只要是帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白都可以被吸 附，所以要想得到好的純化效果，必須選擇好純化的條件，通常帶組氨酸蛋白都 可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝膠或鎳 NT

6、A瓊脂糖凝膠吸附，但是如果標(biāo)簽折疊 在蛋白內(nèi)部不容易暴露，這樣就難純化，如果鎳瓊脂糖凝膠都不能吸附，可以在 樣品和平衡緩沖液中加1-2M脲，這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，也許能吸附而蛋白不 會(huì)變性，對(duì)于本身就是變性的蛋白如果 8M脲不能吸附，改用6M鹽酸胍溶解樣品 就可以被吸附，因?yàn)辂}酸胍可以打開脲打不開的結(jié)構(gòu)使得標(biāo)簽?zāi)鼙┞?。?dāng)然如果有二硫鍵最好加1-2mMDT也可以更好解決吸附的問題。此外也可以把標(biāo)簽換到另外一端。緩沖體系，pH及鹽濃度對(duì)于一些作用力弱的蛋白不能選擇帶氮原子的的一些緩沖體系，如 Tris-HCI等，適當(dāng)提高緩沖液pH可以增加吸附效果，同樣原理可以降低pH洗脫一些咪唑洗不去的雜帶。為避

7、免由于電荷作用的干擾，平衡緩沖液中需要加氯 化鈉，而在平衡緩沖液添加吐溫或者 trito n 可以降低由于疏水相互作用導(dǎo)致的 非特異吸附。表面活性劑及其他添加劑添加一些表面活性劑可以增加蛋白的溶解度，降低疏水相互作用，這樣使純化的結(jié)果更好，在實(shí)驗(yàn)表明在平衡緩沖液中加的吐溫可以使電泳的背景更清晰， 雜帶減少。對(duì)一些難溶解的樣品也可以加乙醇或者甘油。在變性條件下有時(shí)會(huì)在 樣品中添加還原劑如巰基乙醇或者二巰基蘇木糖醇，它們?nèi)绻麧舛冗^高或者上樣量過大，會(huì)導(dǎo)致鎳離子還原甚至脫落，使填料失效，如果要在這樣的環(huán)境下，那 最好選擇螯合價(jià)位高的填料如鎳NTA瓊脂糖凝膠或降低還原劑的濃度，通常1-2mM是沒問題的

8、。如果一定要選擇高濃度的還原劑，也可以把鎳離子還成鉆離 子，它不怕還原，把普通的鎳瓊脂糖凝膠還成鉆離子即可。以下是破碎及提取、純化操作和常見問題解決方法：破碎方法樣品的處理對(duì)純化是很重要的，重要的原則是破碎要溫和，不能使蛋白斷裂或者 降解，否則一些片段同樣也帶有標(biāo)簽， 這樣增加了純化的難度。需要注意的問題 是超聲破碎溫度，強(qiáng)度，時(shí)間大腸桿菌的破碎方法：1） 收集培養(yǎng)發(fā)酵液，4度7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀的菌體（如果不 是馬上破碎可以放-70度冷凍，但是最好能保存成小塊或者薄片，這樣好用。 ）2）取1-2克菌體加10ml破碎緩沖液（的50mM磷酸緩沖液含NaCI，ml溶菌酶， 1

9、mM PMSF 1mM MgCl2 ml Benzonase,其中的菌酶，1mM PMSF ml Benzonase 現(xiàn)加）在冰上混合45分鐘，如果pH不在7-8，需要用NaOH邊攪拌一邊滴加. 如果溶菌酶10mg/ml混合時(shí)間可以縮短到10分鐘.3） 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎 20秒種,總共四次，中間間隔要保持2 分鐘冷卻破碎液,檢測(cè)pH,如果不在7-8,還是用NaOH一邊攪拌一邊滴加去調(diào)如 果菌體的為50-500克，可以高壓破碎的方法，緩沖液同上，體積為1升,破碎三次， 壓力為800 bar.4） 破碎的液4度12000g離心10分鐘，如果要讓溶液更澄清，可以4度50000g 離心

10、30分鐘，這時(shí)候可以把上清和沉淀分別留樣，跑電泳，如果只沉淀中有目 標(biāo)蛋白，那就用變性條件下去提取。5） 破碎離心的上清加2M咪唑溶液使終濃度為20mM樣品的總體積為10ml。過 柱子的樣品最好過ym的濾膜，避免堵柱。2.1)可溶性蛋白的純化平衡緩沖液：的50mM磷酸緩沖液含NaCI，含20mM咪唑。2)洗脫緩沖液：的50mM磷酸緩沖液含NaCI，含500mM咪唑。3)取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以min上樣，然后2ml/管分管收集。4)用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速 1-2ml/min，2ml/管收集

11、。5)用5 ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速 1-2ml/min，2ml/管收集。6)再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20聽醇，封閉，以備下次使用。7)此方法是通用的方法，但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果， 所以優(yōu)化的辦法是洗脫可以用50mMI 100mM 300mM 500mM分階段洗脫，各洗脫5個(gè)柱體積，這樣配合電泳檢測(cè)，得到適合自己的蛋白的條件。8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考瑪斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的濃 度，再取有蛋白的部分電泳檢測(cè)純度。3.常見問題及解決方法1）蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH,此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增

12、加疏水性蛋白的溶解度，避免沉淀。2) 蛋白不吸附：這是最常見的，通常的原因有 1 是標(biāo)簽不暴露，被折疊在蛋白 的結(jié)構(gòu)內(nèi)，可以在變性的條件下去純化， 2 可以選擇作用力更強(qiáng)，配基密度更高 的填料，通常鎳瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng)， 如果蛋白分子量大可以選擇手臂長(zhǎng)的填 料，如鎳NTA瓊脂糖凝膠，填料的好壞可以看填料的顏色，顏色越深那配基密度 越高，作用力也相應(yīng)要強(qiáng)。3樣品的pH過低或者沉淀導(dǎo)致不能吸附，所以樣品 和緩沖液的pH要盡量一致，避免沉淀，通常再偏堿性條件下吸附更好。3) 難洗脫：如果穿透中目標(biāo)蛋白明顯減少，而洗脫又沒有，取點(diǎn)填料加電泳緩 沖液煮后離心跑電泳還是有目標(biāo)蛋白， 可以用更強(qiáng)的洗脫條件

13、如500mM咪唑，如 果還不能洗脫，可以直接用500mM咪唑加到6M鹽酸胍去洗脫。4) 電泳雜帶多：因?yàn)檫@種親和畢竟特異性要差點(diǎn)，原因在蛋白中帶組氨酸，色 氨酸，半胱氨酸等很常見，特別是蛋白折疊會(huì)導(dǎo)致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近， 這樣也會(huì)使它們和鎳柱的作用力增加， 因此可以用不同濃度的咪唑階段洗脫， 此 外在咪唑洗脫前增加一步 pH5 的醋酸緩沖液洗脫， 在平衡緩沖液中添加 %吐溫或 Triton 可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附，這樣可以電泳的雜帶明顯 減少，但是如果用這樣的方法還是雜帶多， 那就地回頭去看看破碎的條件是不是 太劇烈或者溫度控制不好導(dǎo)致蛋白短裂或者分解導(dǎo)致一些蛋白片段帶標(biāo)

14、簽， 或者 因?yàn)闃悠烽L(zhǎng)時(shí)間保存導(dǎo)致水解等， 總之純化的好壞決定于每一個(gè)步驟， 不僅僅是 純化的問題。還有一個(gè)不容忽略的問題是有時(shí)候因?yàn)榈鞍紫嗷プ饔没蛘咭驗(yàn)樾纬?聚合體導(dǎo)致雜帶增加， 而由于疏水相互作用或者因?yàn)殡x子作用可以通過添加表面 活性劑或者增加離子強(qiáng)度得到改善， 對(duì)于因?yàn)樾纬删酆象w的可以在緩沖液和樣品 中加1-2mM巰基乙醇避免，如果這樣的情況下最好是選擇鎳 NTA®脂糖凝膠，因 為它在還原劑下更穩(wěn)定。包涵體蛋白的純化及復(fù)性包涵體破碎1 、大腸桿菌的破碎方法：1 )收集培養(yǎng)發(fā)酵液，4度7000-8000g離心10分鐘，收集沉淀的菌體(如果不 是馬上破碎可以放 -70 度冷凍，但是

15、最好能保存成小塊或者薄片，這樣好用。2 ）取 1-2 克菌體加 10ml 破碎緩沖液（50mMTris-HCI ,2mMEDTA100mlNaCI, %Triton X-100 , 1mg/ml溶菌酶。）在冰上混合 45分鐘。3 ）把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎 20秒種，總共四次，中間間隔要保持2 分鐘冷卻破碎液,檢測(cè)pH,如果不在,還是用IMTris溶液一邊攪拌一邊滴加去調(diào). 如果菌體的為 50-500 克, 可以高壓破碎的方法 , 緩沖液同上 , 體積為 1 升, 破碎三 次 , 壓力為 800 bar.4 ）破碎的液4度12000g離心10分鐘，如果要讓溶液更澄清，可以4度50000

16、g 離心 30 分鐘,這時(shí)候可以把上清和沉淀分別留樣,跑電泳,如果只沉淀中有目 標(biāo)蛋白,那就用變性條件下去提取。5 ）破碎離心的沉淀用4M清洗包涵體，再離心得沉淀加（的50mM磷酸緩沖液含 NaCl, 8M脲，20mM咪唑）。過柱子的樣品最好過 叩的濾膜，避免堵柱。4 包涵體蛋白的純化1） 平衡緩沖液：的50mM磷酸緩沖液含NaCI，8M脲，20mM咪唑。2） 洗脫緩沖液：的50mM磷酸緩沖液含NaCI，8M脲，含500mM咪坐。3） 取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖 液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以min上樣，然后2ml/管分管收集。4）用15m

17、l平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速 1-2ml/min , 2ml/管收集。5） 用5 ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速 1-2ml/min , 2ml/管收集。6）再用 5ml 平衡緩沖液平衡柱子，灌滿 20%乙醇，封閉，以備下次使用。7）此方法是通用的方法， 但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果， 所以優(yōu)化 的辦法是洗脫可以用50mM 100mM 300mM 500mM分階段洗脫，各洗脫5個(gè)柱體 積，這樣配合電泳檢測(cè)，得到適合自己的蛋白的條件。8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考瑪斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白的濃 度，再取有蛋白的部分電泳檢測(cè)純度。9）其問題和解決方法可以參考可溶性蛋

18、白的純化的相關(guān)內(nèi)容。 復(fù)性十分復(fù)雜，所以建議參考文獻(xiàn)和一些專門的論述。常見問題及解決方法1) 不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的 pH,此外在樣品中添加一些表 面活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度， 對(duì)于帶半胱氨酸多 的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加 2-5mM巰基乙醇避免沉淀。2) 白不吸附：這是最常見的,通常的原因有 1 是標(biāo)簽不暴露,被折疊在蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi),可以在變性的條件下去純化, 如果用脲變性吸附不好, 可以改用鹽酸胍, 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是這樣通?？梢允刮讲簧系牡鞍椎玫礁纳?順利純化。2 可以選擇作用力更強(qiáng), 配基密度更高的填料, 通常鎳瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng), 如果蛋白分子 量大可以選擇手臂長(zhǎng)的填料，如鎳NTA瓊脂糖凝膠，填料的好壞可以看填料的顏 色,顏色越深那配基密度越高,作用力也相應(yīng)要強(qiáng)。 3 樣品的 pH 過低或者沉淀 導(dǎo)致不能吸附