PCR污染原因與檢測方法

1、PCR 污染原因與檢測方法PCR 反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題 是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因一、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時， 由于密封不嚴溢于容器外， 或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染； 標本核酸 模板在提取過程中， 由于吸樣槍污染導致標本間污染； 有些微生物標本尤其是病 毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。二、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、 雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。三、PCR 擴增產物污染： 這是 PCR 反應中最主要

2、最常見的污染問題。 因為 PCR 產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml ），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限， 所以極微量的 PCR 產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成 PCR 產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與 液體面摩擦時就可形成氣溶膠， 在操作時比較劇烈地搖動反應管， 開蓋時、 吸樣 時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。 據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。四、實驗室中克隆質粒的污染： 在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對 照的檢驗室， 這個問題也比較常見。 因為克隆質粒在單位容積內含

3、量相當高， 另 外在純化過程中需用較多的用具及試劑， 而且在活細胞內的質粒， 由于活細胞的 生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測， 考慮有無污染是什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染。對照試驗一、陽性對照： 在建立 PCR 反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有 PCR 陽性對 照，它是 PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重 要的參考標志。 陽性對照要選擇擴增度中等、 重復性好， 經(jīng)各種鑒定是該產物的 標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（ 100 個拷貝以下）。但 陽性對照尤其是

4、重組質粒及高濃度陽性標本， 其對檢測或擴增樣品污染的可能性 很大。因而當某一 PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的 實驗中可免設陽性對照。二、陰性對照：每次 PCR 實驗務必做陰性對照。它包括：1. 標本對照： 被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照； 被檢的標本是組 織細胞就用相應的組織細胞作對照。2. 試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試 劑是否污染。三、重復性試驗。四、選擇不同區(qū)域的引物進行 PCR 擴增。防止污染的方法一、 污染的預防進行 PCR 操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能 出現(xiàn)的 PCR 污

5、染或杜絕污染的出現(xiàn)。1. 劃分操作區(qū)：目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但 無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行， PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行：(1) 標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備。(2) 擴增區(qū)，包括反應液的配制和 PCR 擴增。(3) 產物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。(4) 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備一 PCR擴增一產物分析一產物處理。切記：產物分析區(qū)的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。2. 分裝試劑： PCR 擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或

6、負壓工 作臺配制和分裝。 所有的加樣器和吸頭需固定放于其中， 不能用來吸取擴增后的DNA 和其他來源的 DNA：(1) PCR 用水應為高壓的雙蒸水。(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴增產物區(qū)配制。(3) 引物和 dNTP 應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因3. 實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因， 樣品間的交叉污染也是原因之一。 因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真， 在 樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。(2) 使用一次性吸頭， 嚴禁與 PCR 產物分析室

7、的吸頭混用， 吸頭不要長時間暴露 于空氣中，避免氣溶膠的污染。(3) 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于 管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。(4) 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將 dNTP 、緩沖液、引物和酶混合好， 然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。(5) 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。(6) 操作時設立陰陽性對照和空白對照， 即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié) 助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或 標本 DNA 的污染，最好

8、使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加 樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應該專用， 不能交叉使用， 尤其是 PCR 產物 分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。(8) 重復實驗，驗證結果，慎下結論、追蹤污染源 如果不慎發(fā)生污染情況，應從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染 1. 設立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時， 應選擇擴增弱，且重復性好的樣品， 因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列， 反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照， 100 個拷貝 之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為 PCR 敏感 性極高，可以從其

9、它方法( Sourthern 印跡或點雜交等)檢測陰性的標本中檢 測出極微量的靶分子。 此外，每次擴增均應包括 PCR 體系中各試劑的時機對照， 即包括 PCR 反應所需的全部成分， 而不加模板 DNA, 這對監(jiān)測試劑中 PCR 產物 殘留污染是非常有益的。 如果擴增結果中試劑對照為陽性結果， 就是某一種或數(shù) 種試劑被污染了。 此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增， 擴增時設立不同的 反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。2.環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外， 更換試劑后， 若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污 染了，如果預防措施比較嚴密， 則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的

10、污染 源主要有：(1) 模板提取時真空抽干裝置。(2) 凝膠電泳加樣器。(3) 電泳裝置。(4) 紫外分析儀。(5) 切膠用刀或手術刀片。(6) 離心機。(7) 冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等。此時可用擦拭實驗來查找可疑 污染源： (a) 用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。 (b)0.1ml 去離子水浸泡。 (c) 取 5ml 做 PCR 實驗。 (d) 電泳檢測結果。(8) 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗， 仍不能查找到確切污染源， 則污染可能是由空氣中 PCR 產物的氣溶膠造成的， 此時就應該更換實驗場所， 若條件不允許， 則重新設計新 的引物(與原引物無相關性)。三、污染處理

11、1. 環(huán)境污染(1) 稀酸處理法：對可疑器具用 1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA 脫嘌呤。(2) 紫外照射( UV )法：紫外波長( nm )一般選擇 254/300nm, 照射 30min 即可。需要注意的是，選擇 UV 作為消除殘留 PCR 產物污染時，要考慮 PCR 產 物的長度與產物序列中堿基的分布， UV 照射僅對 500bp 以上長片段有效，對 短片段效果不大。 UV 照射時， PCR 產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體 可使延伸終止，但并不是 DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且 UV 照射還可 使二聚體斷裂。 形成二聚體的程度取決于 UV 波長，嘧啶二聚體的類

12、型及與二聚 體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長 DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少 于 0.065/ 堿基，其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶 乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯(lián)和DNA斷裂等)均可終止Taq DNA聚合酶的 延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當。 如果這些位點 (0.13/ 堿基)在 DNA 分子上隨機分布，一個 500bp 片段的 DNA 分子鏈上將有 32 處損傷位點，那 么，105 個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果 100bp 的 片段，每條鏈上僅有 6 處損傷， 105 個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。 這就是 UV 照射

13、有一定的片段長度限制的原因。2. 反應液污染可采用下列方法之一處理：(1) DNase I 法：PCR混合液(未加模板和 Taq聚合酶)加入0.5U DNase I, 室溫反應 30 min 后加熱滅活，然后加入模板和 Taq 聚合酶進行正常 PCR 擴增 該方法的優(yōu)點是不需要知道污染 DNA 的序列。(2) 內切酶法：選擇識別 4 個堿基的內切酶(如 Msp I 和 Taq I 等)，可同時選 擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷， 室溫作用 1h 后加熱滅活進 行 PCR。(3) 紫外照射法：未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液進行紫外照射，注意事 項與方法同上述 UV 照

14、射法。(4) g 射線輻射法： 1.5kGy 的輻射可完全破壞 0.1ng 基因組 DNA,2.0 kGy 可 破壞 104 拷貝的質粒分子， 4.0 kGy 仍不影響 PCR, 但高于此限度會使 PCR 擴 增效率下降。引物可受照射而不影響 PCR,g 射線是通過水的離子化產生自由基 來破壞 DNA 的。3. 尿嘧啶糖苷酶( UNG )法 由于 UV 照射的去污染作用對 500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴增片段通常為 300bp 左右，因此 UNG 的預防作用日益受到重視和肯定 (1) 原理：在 PCR 產物或引物中用 dU 代替 dT. 這種 dU 化的 PCR 產

15、物與 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的 N- 糖基鍵，可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸， 從而失去被再擴增的能力。 UNG 對不含 dU 的 模板無任何影響。 UNG 可從單或雙鏈 DNA 中消除尿嘧啶，而對 RNA 中的尿嘧 啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。(2) dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP, 使產物中摻入大量 dU. 在再次進行 PCR 擴增 前，用 UNG 處理 PCR 混合液即可消除 PCR 產物的殘留污染。由于 UNG 在 PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含 dU 的新的 PCR 產物。(3) dU引物法：

16、合成引物時以dU代dT,這樣PCR產物中僅5 /端帶dU.UNG 處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段( 1-2kb 以上)的擴增用 dUTP 法效率較用 dTTP 低，而用 dU 法就可克服這一缺點。 dU 引物最好將 dU 設計在3/端或近/端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。(4) 優(yōu)點：可以去除任何來源的污染； UNG 處理可以和 PCR 擴增在同一個反應 管內進行；由于擴增產物中有大量 dU 存在，可徹底消除污染源。(5) 需注意的是摻入 dUTP 的 DNA 不應對產物的任何操作有影響，在進行 PCR 產物克隆時，應該轉化 UNG- ( UNG 缺陷)大腸桿菌受體菌，否則

17、轉化產物會 被受體菌 UNG 消化掉。4. 固相捕獲法用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：(1 )用一生物素標記的單鏈 RNA 探針與待擴核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴增區(qū)。(2 )用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸， 通過漂洗 可去除污染的擴增產物和雜質(3 )洗脫靶分子后用特異引物擴增非 RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可 用 PCR 檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。5. RS-PCR 法( RNA-specific PCR )也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低 假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的 3 /端(A 區(qū))有2 0個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5 /端2 0個核苷酸(C區(qū)) 為附加修飾堿基。與 mRNA 逆轉錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA 與多余引物