血清清蛋白γ-球蛋白的分離提純與鑒定

1、血清清蛋白、Y -球蛋白的分離、提純與鑒定一、實驗?zāi)康?. 掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法；2. 掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法；3. 了解柱層析技術(shù)。二、實驗原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實驗利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技術(shù)觀察蛋白質(zhì)分 離教果。1鹽析蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因為有兩個穩(wěn)定因素： 表面的電荷和水化膜 。 當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質(zhì)分子沉淀 析出的方法很多，根據(jù)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重 金屬鹽法以及生物

2、堿試劑法等。 鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸銨(NH 4) 2SO4)等對蛋 白質(zhì)作用破壞了蛋白質(zhì)表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白質(zhì)相互聚集而析 出。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析 所需的鹽濃度也不同，因此調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。 血清球蛋白在半飽和狀態(tài)下發(fā)生沉淀，而血清清蛋白在完全飽和狀態(tài)下沉淀 ，利用此特 性可把蛋白質(zhì)分段沉淀下來，即在半飽和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，離 心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸餾水即可溶解，由此達到分離清蛋白和 白蛋白的目的。2脫鹽 鹽析得到的蛋白質(zhì)含有高濃度中性鹽

3、，需要有脫鹽過程去除蛋白質(zhì)遺留的中性鹽，常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實驗采用凝膠層析法脫鹽，在葡聚糖凝 膠柱中，蛋白質(zhì)與鹽的分子量不同，當(dāng)樣品通過層析柱時，分子量較大的蛋白質(zhì)因為不能通過網(wǎng)孔而進入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動，所以流程較短，向前移動速度較快，最先流出層析柱；反之，鹽的分子量較小，可通過網(wǎng)孔而進入凝膠顆粒，所以流程長，向前移動速度較慢，流出層析柱的時間較后。分段收集蛋白質(zhì)洗脫液，即可得 到脫鹽的蛋白質(zhì)。3.純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進行可逆的的交換過程 。帶正電荷的交 換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。本實

4、驗采用的 DEAE 纖維素是一種陰離子交換劑， 溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進 行交換結(jié)合，帶正電荷的點正電荷的離子則不能，這樣便可達到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白， 利用它們的等電點的不同可進行分離 。血 清中各種蛋白質(zhì)的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷 不同，可以通過 DEAE 離子交換層析將血清清蛋白和伽馬球蛋白分離出來。4. 純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于PH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。 由于血漿中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的 電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電

5、泳的速度也不同 。因此可以將它們分離為清蛋 白（Albumi n）、a-球蛋白、a2球蛋白、3球蛋白、y球蛋白5條區(qū)帶。三、材料與方法：以流程圖示意1.實驗材料人血清、葡聚糖凝膠 G-25（Sephadex G-25）層析柱、二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素離子交換層析柱、飽和硫酸銨溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.06mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、0.02mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液、1.5mol/l的NaCI-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCI2溶液、電泳儀、電泳槽。2實驗方法1）實驗流程2）實驗步驟 鹽析：中性鹽沉淀步驟步驟操作（1

6、）鹽析取離心管一個，加入0.8mol人或動物血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸銨溶液 0.8ml，混勻后室溫下放置10min，離心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用（2）溶解向離心管的沉淀加入0.6mol蒸餾水，振搖使之溶解，作為純化沉淀丫球蛋白用:上層清夜盡量全部吸出，但不可吸出沉淀物 脫鹽：過凝膠層析柱步驟步驟操作(1)調(diào)節(jié)層析柱液面葡萄糖凝膠G-25層析柱經(jīng)0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓儲液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層析柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床液面(2)加樣品用細(xì)長滴管吸取上述經(jīng)鹽析所得的粗制蛋

7、白質(zhì)溶液，小心而緩慢 的加入凝膠床上面，柱下端用 10ml刻度離心管接液，擰松柱下 螺旋夾，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速，使樣品進入凝膠床，至液面降到凝膠床 表面為止(3)洗層析柱小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌層析柱內(nèi)壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液(4)洗脫待樣品液進入凝膠床內(nèi)，繼續(xù)用 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗，同時注意流出液量(5)檢測及收集蛋白質(zhì)在黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)加2滴0.92mol/L磺基水楊酸，隨時檢查 流出液是否含有蛋白質(zhì)，滴流出液1滴黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)接觸 到磺基水楊酸溶液，若出先白色混濁或沉淀，表示已有蛋白質(zhì)流 出(當(dāng)凝膠床體積為5.5m

8、l時，流出的液體量約為2ml就可能有 蛋白質(zhì)流出)，立即收集流出的蛋白質(zhì)溶液。收集約12滴后,滴流出液1滴于預(yù)先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反應(yīng)板 凹孔內(nèi)，一旦見出現(xiàn)白色沉淀(表示有 SO42-)，立即停止收集 收集的蛋白質(zhì)溶液即可分別過 DEAE纖維素柱，進行離子交換層 析(6)層析柱再生平收集蛋白質(zhì)溶液后的凝膠層析柱繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC衡緩沖液流洗，用BaCl2液檢測層析柱流出液，當(dāng)流出液用 BaCl2檢查SO42-為陰性后，繼續(xù)洗滌23ml。凝膠層析柱即可再生平衡， 可再次使用注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時

9、，不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢 加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋇混淆，因為二者相應(yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意及時收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。e.葡萄糖凝膠價錢昂貴，要回收再生避免損耗, 嚴(yán)禁倒掉。 球蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱步驟操作（1）調(diào)節(jié)層析柱換沖液面經(jīng)處理再生好的DEAE纖維素層析柱，取下其恒壓儲液瓶 管塞。小心控制柱下端螺旋夾，使柱上緩沖液面剛好下降到 纖維素床表面。柱下端用10ml刻度離心管收集液體，以便 了解加樣后液

10、體的流出量。（2）加樣品將除除鹽后收集的球蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調(diào)節(jié)層 析柱下端的螺旋夾使樣品進入纖維素柱床，至液面降到纖維 素柱床表面為止。（3）析層析小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸銨緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液。（4）洗脫待樣品進入纖維素柱床內(nèi)，繼續(xù)用 0.02mol/L PH 6.5的醋酸銨緩沖液流洗，。同時注意流出液量（5）檢測及收集蛋白質(zhì)流洗時，隨時用0.92mol/L磺基水楊酸檢查流出液中是否含 蛋白質(zhì)（方法同前）當(dāng)有蛋白質(zhì)出現(xiàn)時，立即連續(xù)收集三管， 每管10滴，。此不被DEAE纖維素吸附的蛋白質(zhì)即為純化 的Y球蛋白，取其中蛋白質(zhì)濃度最高的一管留作

11、鑒定用。注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時，不要使液面低于 纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢 加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋇混淆，因為二者相應(yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意及時收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，特別是收集伽馬球蛋白時。 清蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱步驟操作(1)調(diào)節(jié)層析柱緩沖液面此時DEAE纖維素層析柱不必再生，可直接用于純化清蛋白 小心控制住下端螺旋夾，使柱上緩沖液面剛好下降到纖維素床 表面，柱下端用10ml刻

12、度離心管收集液體，以便了解加樣后 液體流出量(2)加樣品將除鹽后收集的清蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調(diào)節(jié)層析柱下端的螺旋夾，使樣品進入纖維素柱床，至液面降到纖維素柱床表面為止(3)洗層析柱將除鹽的粗制清蛋白溶液上柱后，改到0.06mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液洗脫小心用1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液(4)洗脫待樣品進入纖維素柱床內(nèi)，繼續(xù)用 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC 緩沖液流洗。同時注意流出液量。流出約 6ml (其中含a球蛋 白及3球蛋白)后，將柱上的緩沖液面降至與纖維素表面平齊。改用0.3mol/L、pH6.5

13、NH4AC緩沖液洗脫(5)檢測及收集蛋白質(zhì)用0.92mol/L(20%)磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)(方 法同前)。由于純化的清蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì)，故肉眼可見一層淺黃色的成分被 0.3mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖 液洗脫下來，大約改用 0.3mol/L NH4AC緩沖液洗脫約 2.5ml 時，即可在流出液中試出有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，立即連續(xù)收集 2管，每管10滴，此即為純化的清蛋白液，留作純度鑒定用(6)纖維素層析住的再生與平衡用過的DEAE纖維素層析柱，應(yīng)重新再生平衡先用約 6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC 溶液流洗，再用0.02mol/L

14、 pH6.5 NH4AC液約10ml流洗平衡即可注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖頁面或樣品頁面剛好下降到纖維素膜表層時，不要是液面低于 纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢 加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。 C.使用時切勿將各時段所用的溶液 濃度搞混。d.洗脫是應(yīng)注意及時收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。 純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳）步驟操作準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備：將電泳槽置于水平平臺上，兩側(cè)注入等量的巴比妥 緩沖溶液，使其在同一水平a，頁面與支架距離22.5cm,用三層 濾紙或雙層紗布搭橋溥膜準(zhǔn)備：將醋酸纖維溥膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在溥

15、膜一段1.5cm處用鉛筆輕輕畫上一條橫線為點樣線，末端用鉛筆 做記號。進入巴比妥溶液中直至浸潤完全。用鑷子青青取出，粗 面朝上，平放在兩層干濾紙中間，輕輕拭去多余的緩沖液。點樣薄膜片置于干凈的玻璃或濾紙片上，粗面朝上，用玻片或載玻片 一段的截面在盛有樣品的直接沾取 23微升待測品，讓后將樣品 與薄膜點樣先輕輕接觸，均勻分布在點樣線上，帶樣品滲入薄膜 后移開，四種樣品分別點樣。電泳將已點好的樣品薄膜放在鋪有濾紙鹽橋的電泳槽上， 點樣面朝下， 點樣端至陰極，輕輕拉平薄膜。平衡約 5min，使緩沖液滲透大道 平衡。接好電路，調(diào)節(jié)電壓開始電泳。待各個樣品沒有變化停止 電泳，并輕輕取出。染色漂洗和鑒定將

16、染色液倒入大培養(yǎng)皿中，電泳完畢后用鑷子取出薄膜，直接浸 入染色約5min。后將薄膜取出，漂洗至背景無色，觀察電泳情況得出結(jié)論四、結(jié)果與討論：結(jié)果：實驗數(shù)據(jù)、現(xiàn)象、圖譜；討論：以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推 論，并得出結(jié)論。1實驗結(jié)果從電泳圖譜中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白質(zhì)與血清的清蛋白電泳 圖譜幾乎一致，可以確定管內(nèi)的蛋白質(zhì)為清蛋白，同理球蛋白管內(nèi)的蛋白質(zhì)為丫 -球蛋白。2. 實驗討論1）血清電泳中個別電泳帶的兩條帶之間界限不明顯 染色時，醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色固定前，薄膜與薄膜之 間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。 染色時間控制不合適。因為時間長，薄膜

17、底色深不易脫去；時間短，著色淺不宜區(qū)分，或造成條帶染色不均； 透明時間控制不合適，如在透明液中浸泡時間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。2）第一管血清蛋白電泳帶參差不齊 薄膜表面吸干時吸的太干或吸的不完全。因為點樣時應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用 濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄 膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果； 點樣不均勻。3）第一管血清蛋白中含有少量雜質(zhì)致使電泳圖出現(xiàn)偏差。思考題1.硫酸銨鹽析一步，為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?血清球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中發(fā)生沉淀， 而血清清蛋白在完全飽和硫酸銨溶液 中沉淀，將血清和飽和硫酸銨等體積混合后，其狀態(tài)相當(dāng)于在半飽和硫酸銨溶液中，在此狀態(tài)下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，因而可以將其分開。2. 為什么實驗中DEAE纖維素柱分離y球蛋白后不用再生，可直接用于純化清蛋白？因為y球蛋白帶正電荷，不與DEAE結(jié)合，會從層析柱中首先洗脫出來，所以分離 Y球蛋白后可直接用于純化清蛋白。3. 應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定分離純化后的血清清蛋白和Y球蛋白的純度，根據(jù)什么來確定它是清蛋白還是 Y球蛋白？判定它們純度的依據(jù)是什