谷物種子蛋白質(zhì)中賴氨酸含量的測(cè)定

1、谷物種子蛋白質(zhì)中賴氨酸含量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆哲崛壬y(cè)定氨基酸含量的原理和方法 ，測(cè)定谷物種子蛋白質(zhì)中賴氨酸 含量。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)中的賴氨酸具有一個(gè)游離的&NH2，它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴氨酸的含量成線性關(guān)系。因此，用已知濃度的游離氨基酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)比色分析（530nm ）即可測(cè)定出樣品中的賴 氨酸含量。亮氨酸與賴氨酸的碳原子數(shù)目相同，而且僅有 一個(gè)游離氨基（&NH 2），所以通常 用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。但由于這兩種氨基酸分子質(zhì)量不同， 以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算 賴氨酸含量時(shí)，應(yīng)乘以校正系數(shù)1.1515，最后再減去樣品中游離氨基酸

2、含量。三、實(shí)驗(yàn)儀器1 電子分析天平（1/1000 ）、可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、干燥器、移液 器。2 試管架（塑及鋁）、具塞試管、具塞三角瓶、細(xì)口瓶、漏斗（或 0.45um 濾 膜）、吸管等。四、實(shí)驗(yàn)試劑1 . 0.4mol/L 檸檬酸緩沖液：稱取4.202g檸檬酸和5.88g檸檬酸三鈉，溶于 100ml蒸餾水中。2 .茚三酮試劑：稱40mg二氯化錫（防腐）溶于25ml檸檬酸緩沖液中；稱lg 茚三酮溶于25ml 95 %乙醇中；將上述兩液混合搖勻，濾去沉淀，上清液置冰箱中保存?zhèn)溆谩? . 0.02mol/L 鹽酸：取12mol/L 鹽酸0.17ml，用蒸餾水稀釋定容至100ml。4 .亮氨酸

3、標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取20mg亮氨酸，加數(shù)滴0.02mol/L 鹽酸使之溶解， 然后用蒸餾水稀釋定容到100ml，則得濃度為200g /ml的標(biāo)準(zhǔn)液。5 . 60 %乙醇。6 . 4 %碳酸鈉：稱取4g無(wú)水碳酸鈉，溶于100 ml蒸餾水。7 . 2 %碳酸鈉。五、操作步驟1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取7支具塞試管，按表進(jìn)行編號(hào)、加入試劑，順序操作。以第1管為空白，在530nm波長(zhǎng)下比色，讀取吸光度值。并以吸光度值為縱坐標(biāo)，亮氨酸含量（yg 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 樣品前處理不同品種的玉米種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80100目篩子，收集過(guò)篩后的細(xì)粉， 放入廣口瓶中，加入沸程6090 C的石油醚，使其淹過(guò)粉面，

4、浸泡 8小時(shí), 不時(shí)搖動(dòng)進(jìn)行脫脂。然后過(guò)濾，并用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂 玉米粉涼在干凈的濾紙上，置陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置于干燥器內(nèi)， 保存?zhèn)溆谩? .樣品的測(cè)定取15mg已粉碎脫脂的玉米樣品于具塞干燥試管內(nèi)，加2%碳酸鈉1.0ml，于80 C水浴中提取20min，然后加茚三酮試劑2.0mI ,繼續(xù)保溫顯色30min ， 冷卻后加60 %乙醇3.0ml，混勻后過(guò)濾或離心，然后在530nm 波長(zhǎng)下比色。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品中賴氨酸的含量（% ）=從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值（yg） X10-3/（樣品重mg） X 1.1515 X100%-C校正系數(shù)：1.1515 ; C:游離的氨基

5、酸含量七、注意事項(xiàng)1 各種作物種子中游離氨基酸含量是：玉米0.01 %、小麥0.05 %、水稻0.01 %、 高糧0.04 %。2 茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH、時(shí)間影響較大，如果要使實(shí)驗(yàn)結(jié)果能很好重復(fù)， 必須嚴(yán)格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會(huì)使氨基酸不易顯色。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品測(cè)定參考表試管號(hào)試劑1#（空白）2#3#4#5#6#7#（樣品）亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.10.20.30.40.5/蒸餾水（ml）0.50.40.30.20.10/亮氨酸含量（y g）020406080100/4%碳酸鈉（ml）0.50.50.50.50.50.5/脫脂樣品（mg）/152%碳酸鈉（ml）/1.

6、0/80C水浴20分鐘茚三酮試劑（ml）2.02.02.02.02.02.02.0混勻，加塞，80C水浴30分鐘，冷卻至室溫60%乙醇（ml）3.03.03.03.03.03.03.0/過(guò)濾混勻A5305蛋白質(zhì)中賴氨酸（lysine , Lys ）的含量是谷物品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。 由于動(dòng)物及人類不能合成，須從食物中得以補(bǔ)充，為此培育高含量賴 氨酸的谷物，對(duì)于提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有重要意義。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶 液顯色法和染料結(jié)合法（Dye Binding Lysine，DBL ）測(cè)玉米種子中賴氨酸含量。一、茚三酮顯色法原理：谷物蛋白中賴氨酸殘基有自由的£-NH 2 ,它與茚三酮（ninhyd

7、rin ）試劑可發(fā)生顏色反應(yīng)，生成紫紅色物質(zhì)， 其顏色與賴氨酸殘基的數(shù)目成正相關(guān)。選用碳原子數(shù)目與賴氨酸相同 的亮氨酸，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可用以測(cè)定谷物蛋白內(nèi)賴 氨酸的含量.二、材料、儀器設(shè)備（一）材料：不同品種的玉米種子，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò) 100目篩子， 收集過(guò)篩后的細(xì)粉，放入廣口瓶?jī)?nèi)，加入沸程 6090 C的石油醚， 使其淹過(guò)粉面，浸泡8h，不時(shí)攪動(dòng)進(jìn)行脫脂。然后過(guò)濾，并用石油 醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂玉米粉晾在干凈的濾紙上， 置 陰涼通風(fēng)處吹干石油醚。收集干粉，置干燥器內(nèi)，保存?zhèn)溆?。（二）儀器設(shè)備：1. 722型分光光度計(jì)；2.水浴鍋；3試管；4.圓 頭玻璃棒（圓頭大小要與試管大小配套）。（三）試劑：1.緩沖溶液，稱取30g甲酸鈉，溶解于約60ml蒸餾 水中，加入10ml8 %的甲酸，