Sepacore應(yīng)用培訓(xùn)-NJ

1、20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 1/26中壓制備色譜和應(yīng)用技巧中壓制備色譜和應(yīng)用技巧20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 2/26色譜分離的機(jī)理色譜分離的機(jī)理流動(dòng)相（流動(dòng)相（Mobile Phase）固定相（固定相（Stationary Phase）樣品（溶解于流動(dòng)相中的溶質(zhì)）樣品（溶解于流動(dòng)相中的溶質(zhì)）20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 3/2621437658酸性角（質(zhì)子給予）堿性角（質(zhì)子接受）偶極角（偶極作用）溶劑選擇性

2、分類三角形圖溶劑選擇性分類三角形圖展開劑的選擇1 ：甲乙醚、乙醚2 ：甲醇、乙醇3 ：DMF、THF4 ：乙二醇、乙酸5：CH2Cl2、二氯乙烷6 ：乙酸乙酯、乙腈7 ：芳烴、芳醚8 ：三氯甲烷、水20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 4/26DCMMEKEtOHEtOH 7Hex 3MEK 9H2O 15:5Give upGive upEA20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 5/26常用（常用（TLCTLC）的展開方法）的展開方法一般用EA：PE(1：16；1：8；1：6；1：2；1

3、：1；2：1；3：1；1：0)對于在EA/PE里不溶解的化合物，可以用CH2Cl2代替以上的PE，但是EA的用量必須減半才能到達(dá)同樣的Rf值。極性較大的化合物：MeOH：CH2Cl2(2.5：100；5：:100；10：100).MeOH量一般不超過10%，否則SiO2會(huì)溶解的。堿性化合物：NH4OH：MeOH：CH2Cl2(0.5：5：100；0.5：10：100).NH4OH是濃氨水。最好先混合NH4OH和MeOH，再加CH2Cl2。酸性化合物：AcOH：MeOH：CH2Cl2(1：5：100；1：10：100)極性非常大的的化合物：H2O：AcOH：MeOH：CH2Cl2(1：2.5：2

4、0：100)。這個(gè)條件什都能展開！但只適合于TLC。在SiO2柱上會(huì)溶解SiO2的。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 6/26裝柱裝柱裝柱一般分為干法裝填和濕法裝填，總的原則是裝填結(jié)實(shí)、高度適中、表面平整。 密度：不結(jié)實(shí)影響柱效 高度：15cm，長則擴(kuò)散或拖尾，短柱效低 表面：平整，不平樣品走不平干法裝填：簡便，易產(chǎn)生氣泡濕法裝填：無氣泡，裝填時(shí)阻力大中壓色譜系統(tǒng)所用硅膠相對粒徑較細(xì)，一般采用干法裝填。硅膠一定要填結(jié)實(shí)、平整；一定要用較多的溶劑“走柱子”，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復(fù)到室溫后再撤去壓力。反相填料采用一般濕法裝填，待在

5、甲醇中超聲脫氣后，再裝填結(jié)實(shí)平整即可。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 7/26上樣上樣干法：樣品拌在硅膠中，鋪在填料的表面。低沸點(diǎn)溶劑中硅膠的質(zhì)量 是樣品質(zhì)量的1.2-1.5倍，旋干后，不能看到明顯的固體顆粒。濕法：將液體或溶液樣品直接加在填料的表面。且對于液體樣品或 粘稠狀半固體樣品只能采用濕法上樣。干法或濕法裝柱都要求盡可能薄的平鋪在硅膠上，太厚會(huì)造成分離效果差或分不開樣品。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 8/26推薦上樣量推薦上樣量20140918_SepcoreBOL

6、IFor internal use onlypage 9/26流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇由于流動(dòng)相對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑 的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜

7、質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50-100nm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。 20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 10/2623110%B100%5%CVCartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOAc Gradient:Linear, 5%B to 100%B i

8、n 60 mL (10 CV)Flow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:10LinearCartridge: FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOAc Gradient:Step 1 - 20%B for 60 mLStep 2 - 75%B for 30 mLFlow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:15231Step15Isocratic%B75%20%0%100%10CVStepCartridge:FLASH 12+S (12 x 75 mm)Eluent:Hexane/EtOAc

9、80:20, isocraticFlow rate:13 mL/minLoad:50 mg# CV:3023Legend1. 1-Nitronaphthalene2. 2-Nitroaniline3. 4-Nitroaniline1203010CVIsocratic洗脫方式洗脫方式20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 11/26 放大條件的摸索放大條件的摸索?20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 12/26放大 增加樣品量 (1)20140918_SepcoreBOLIFor inter

10、nal use onlypage 13/26放大增加載樣量 (2)20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 14/26放大 增加載樣量 (3)裝長柱比短柱困難通常長柱會(huì)因?yàn)闃悠窋U(kuò)散而峰擴(kuò)散.短柱容易操作理論值:放大必須通過增加直徑 !經(jīng)驗(yàn): 2x 直徑 = 1.25 x 長度= 4 x 流速!20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 15/261 根正相柱柱串聯(lián)6 根柱串聯(lián)疊加20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 16/26Sepacore

11、中低壓制備色譜中低壓制備色譜- easily adjustable flow rates- up to 250 ml/min throughput- up to 50 bar pressure- gradient function for binary mixtures20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 17/26C-670 裝柱器裝柱器- 高度相似性用于重復(fù)分離.- 沒有因運(yùn)輸，存儲(chǔ)和老化造成的質(zhì)量問題- 裝柱過程無硅膠浪費(fèi) 最多可節(jié)省50%的硅膠- 壓力最大到 10 bar- 分離過程可視-固定相可用 30-200 m-不同的預(yù)裝柱可

12、選擇 4種塑料柱 1種玻璃柱兩種加壓方式20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 18/26C-601C-601紫紫 外外 檢檢 測測 器器可變波長二極管陣列 C-640: 190 to 840 nm四波長制備型檢測器全波長掃描工作流速高達(dá)500mL/min性能穩(wěn)定，結(jié)實(shí)耐用20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 19/26C-601C-601功能強(qiáng)大的自動(dòng)餾分收集功能強(qiáng)大的自動(dòng)餾分收集 可根據(jù)樣品峰和流動(dòng)相體積收集餾分 多種試管架可供選擇： 內(nèi)置9種試管架定義 用戶可自定義11種試管架最大餾

13、分收集體積：12L 可選配廢液瓶液味監(jiān)測器無論是否配備檢測器都可運(yùn)行20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 20/26控制軟件控制軟件: Sepacore ControlSepacoreControl 控制步琦Sepacore色譜系統(tǒng) 可自動(dòng)偵測系統(tǒng)硬件 方法設(shè)定簡單直觀；平衡、分離及洗柱方法 可自動(dòng)連續(xù)執(zhí)行 多柱間自動(dòng)切換，實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離功能 運(yùn)行中可隨時(shí)改變梯度設(shè)置 可設(shè)定收集的滯后體積，無需擔(dān)心檢測器與 收集器間的死體積 帶硬件維護(hù)功能，方便查看所有硬件信息， 并實(shí)現(xiàn)手動(dòng)控制20140918_SepcoreBOLIFor internal

14、 use onlypage 21/26正向硅膠柱砍段砍段中低壓制備除色素，再砍段除色素，再砍段凝膠柱色譜除色素，再砍段除色素，再砍段制備薄層色譜高壓制備液相半制備HPLC分離流程分離流程20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 22/26正向硅膠柱色譜正向硅膠柱色譜硅膠砍段：目前實(shí)驗(yàn)室有硅膠砍段：目前實(shí)驗(yàn)室有兩種方案，一種是粗砍段，兩種方案，一種是粗砍段，砍成砍成6個(gè)段，一個(gè)星期解決個(gè)段，一個(gè)星期解決（濕法和干法上柱）；（濕法和干法上柱）；一一種是細(xì)砍段，砍成每段種是細(xì)砍段，砍成每段2g左右，左右，20個(gè)段左右，持續(xù)個(gè)段左右，持續(xù)二個(gè)月左右，大

15、柱子下來二個(gè)月左右，大柱子下來可以分到可以分到89個(gè)化合物，之個(gè)化合物，之后不再上硅膠柱。后不再上硅膠柱。20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 23/26中低壓制備色譜中低壓制備色譜摸條件摸條件：反向薄層板，反向薄層板，MeOH，80%，60%， 40%，20%(點(diǎn)樣時(shí)要稀點(diǎn)樣時(shí)要稀) 為了增加洗脫能力有時(shí)候加四氫呋喃為了增加洗脫能力有時(shí)候加四氫呋喃上樣量上樣量：小柱，小柱，10g以下以下, 大柱大柱, 10g以上以上流流 速：速： 小柱，小柱，6mL/min, 大柱大柱, 18mL/min梯度設(shè)置：梯度設(shè)置：30%-40%(1h), 40

16、%(1h), 40%-45%(1h), 45%(1h),.,MeOH, Me(CO)2點(diǎn)板合并：較多水，不好點(diǎn)板時(shí)，可以三個(gè)試管合并濃縮點(diǎn)板合并：較多水，不好點(diǎn)板時(shí)，可以三個(gè)試管合并濃縮后再點(diǎn)板后再點(diǎn)板20140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 24/2620140918_SepcoreBOLIFor internal use onlypage 25/26樣品量大于樣品量大于50mg時(shí)時(shí), 23個(gè)點(diǎn)個(gè)點(diǎn), 可以進(jìn)行薄層制備可以進(jìn)行薄層制備摸條件時(shí)摸條件時(shí), 多試不同體系的展開劑，選出最優(yōu)條件多試不同體系的展開劑，選出最優(yōu)條件上樣量每張板控制在上樣量每張板控制在20mg, 點(diǎn)樣要均勻點(diǎn)樣要均勻, 樣品吹干后方樣品吹干后方可進(jìn)行展開。萬萬不可跑過頭！否則色帶分散很嚴(yán)重可進(jìn)行展開。萬萬不可跑過頭！否則色帶分散很嚴(yán)重!兩個(gè)點(diǎn)兩個(gè)點(diǎn) Rf 值相鄰較近時(shí)值相鄰較近時(shí), 可