蛋白質(zhì)工程的現(xiàn)狀發(fā)展及展望

1、蛋白質(zhì)工程的現(xiàn)狀發(fā)展及展望摘要: 蛋白質(zhì)工程是用分子生物學(xué)手段對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分子改造的技術(shù)。介紹了蛋白質(zhì)工程的幾種常用方法及其基本原理和研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞: 蛋白質(zhì)工程;定點(diǎn)誘變; 定向進(jìn)化20世紀(jì) 70年代以來, 對(duì)蛋白質(zhì)的分子改造漸漸進(jìn)入研究領(lǐng)域, 通過對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行突變, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相對(duì)活力更高的突變體,對(duì)蛋白質(zhì)的分子改造技術(shù)逐漸純熟。蛋白質(zhì)工程的主要技術(shù)分為理性進(jìn)化和非理性進(jìn)化,已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展。1.理性進(jìn)化理性進(jìn)化主要是利用定點(diǎn)誘變技術(shù), 通過在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定長度的核苷酸片段達(dá)到定點(diǎn)突變氨基酸殘基的目的。運(yùn)

2、用該技術(shù)已有不少成功改造蛋白質(zhì)的例子。Markus Roth通過同源性比對(duì)和定點(diǎn)突變技術(shù), 對(duì) EcoR DNA甲基化酶進(jìn)行改造,使其對(duì)胞嘧啶的親和性增加了22倍。定點(diǎn)突變還主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究方面。?；d體蛋白 (ACP的主要作用是在單不飽和脂肪酸的特定位置引入雙鍵, Caho通過定點(diǎn)突變研究, 發(fā)現(xiàn)將五個(gè)氨基酸殘基置換之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脫氫酶變成9- 18 : 0- ACP脫氫酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定點(diǎn)突變技術(shù)結(jié)合的方法將從Bacillus stear other mophilus分離出來的嗜熱菌蛋白酶突變, 得到的突變體穩(wěn)定性提

3、高了8倍, 100 在變性劑存在的情況下還能發(fā)揮作用,但是大部分單個(gè)氨基酸的改變對(duì)于整個(gè)蛋白的影響比較小,很難在高級(jí)結(jié)構(gòu)上改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu), 從而造成很大的影響, 所以在定點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了許多新的技術(shù), 用于改造蛋白質(zhì)分子。12.非理性進(jìn)化非理性蛋白質(zhì)進(jìn)化, 又稱定向進(jìn)化或者體外分子進(jìn)化,在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然進(jìn)化過程, 利用分子生物學(xué)手段在分子水平增加分子多樣性, 結(jié)合高通量篩選技術(shù), 使在自然界中需要千百萬年才能完成的進(jìn)化過程大大縮短,在短期內(nèi)得到理想的變異。這種方法不用事先了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、催化位點(diǎn)等性質(zhì), 而是人為地制造進(jìn)化條件, 在體外對(duì)酶的編碼基因進(jìn)行改造, 定向篩選, 獲得具

4、有預(yù)期特征的改良酶, 在一定程度上彌補(bǔ)了定點(diǎn)誘變技術(shù)的不足, 具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。一個(gè)比較成功應(yīng)用定向進(jìn)化的例子是對(duì)紅色熒光蛋白的改造。綠色熒光蛋白由于本身獨(dú)特的發(fā)光性質(zhì),被應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)中, 作為體內(nèi)原位跟蹤蛋白質(zhì)的一個(gè)極其有效的工具。Dis cosoma紅色熒光蛋白(Ds Red在熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (fluorescen ceresonance energy transfer中可以和綠色熒光蛋白一起作用,作為研究兩種蛋白質(zhì)相互作用的有效工具,但是野生型的Ds Red由于顯色速率較慢,而且穩(wěn)定性較差,Brooke Bevis建立隨機(jī)突變文庫,在103-105個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到了大大

5、提高顯色效率的突變體, 使顯色效率提高了10-15倍。2易錯(cuò)PCR是利用DNA聚合酶不具有3 5校對(duì)功能的性質(zhì), 在PCR擴(kuò)增待進(jìn)化酶基因的反應(yīng)中, 使用低保真度的聚合酶, 改變四種dNTP的比例,加入錳離子并增加鎂離子的濃度, 使DNA聚合酶以較低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變, 并構(gòu)建突變庫。Moore等對(duì)鼠傷寒沙門菌 Salmonella typhmiurium產(chǎn)生的門冬氨酰二肽酶(aspart yldipeptidase進(jìn)行改良, 經(jīng)兩次易錯(cuò)PCR引入隨機(jī)突變, 并結(jié)合 DNA改組和正向選擇篩選, 得到的pepEm3074突變株, 其酶活力比野生菌提高47倍。DNA改組( DNA sh

6、uffling技術(shù)克服了隨機(jī)突變的隨機(jī)性較大的限制,能夠直接將多條基因的有利突變直接重組到一起, 它的原理是使用DNase I酶切或超聲波斷裂多條具有一定同源關(guān)系的蛋白編碼基因, 這些小片段隨機(jī)出現(xiàn)部分片段的重疊, 產(chǎn)生的片段在不加引物的情況下進(jìn)行幾輪PCR,通過隨機(jī)的自身引導(dǎo)或在組裝PCR過程中重新組裝成全長的基因, 由于存在不同的模板, 使得到的全長基因具有不同譜系之間的重組, 再進(jìn)行最后一輪PCR,加入全長引物, 擴(kuò)增得到改造過的全長基因。利用DNA改組已成功進(jìn)化了編碼內(nèi)酰胺酶、葡萄糖苷酶、脂肪酶、綠色熒光蛋白、烷基轉(zhuǎn)移酶、苯甲基脂酶基因以及編碼砷酸鹽和阿特拉津降解酶的整個(gè)操縱子。3在

7、DNA改組技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展出外顯子改組 (exon shuffling和家族改組(family shuffling。外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動(dòng), 而使 DNA改組不受任何限制, 發(fā)生在整個(gè)基因片段上, 更適用于真核生物,并可獲得各種大小的隨機(jī)文庫。交錯(cuò)延伸重組 (stagger edextensi on process , StEP是一種簡化的 DNA shuffling方法,是在 PCR 反應(yīng)中, 將含不同點(diǎn)突變的模板混合, 隨之進(jìn)行多輪變性、 短暫復(fù)性及延伸反應(yīng), 在每一輪中, 那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸,由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的

8、重組, 如此重復(fù)直至獲得全長基因片段。RPR 法 (Random-Prmiing Recombi nation DNA Shuffling是以單鏈DNA為模板, 配合一套隨機(jī)序列引物, 先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段, 由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā), 這些短 DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變,在隨后的PCR反應(yīng)中, 它們互為引物進(jìn)行合成, 伴隨組合, 再組裝成完整的基因長度。過渡模板隨機(jī)嵌合(random chmiera genesis on transient templates, ACHITT技術(shù)是改進(jìn)的基因改組技術(shù), 不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng), 而是將隨機(jī)切割的基因片段雜

9、交到一個(gè)臨時(shí) DNA模板上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接, 其中的懸垂切割步驟可使短片段得以重組,提高重組的頻率和密度。發(fā)酵過程常常由于微生物對(duì)溫度、pH、溶液的影響而導(dǎo)致產(chǎn)量低, 微生物的自身調(diào)控系統(tǒng)十分復(fù)雜和精細(xì), 致使單個(gè)基因的突變很難對(duì)其產(chǎn)生某種產(chǎn)物的能力造成影響,因此, 對(duì)微生物的進(jìn)化要在整個(gè)基因組的水平上進(jìn)行才能起到有效的作用, 于是出現(xiàn)了一種叫全基因組改組(Whole-Genome Shuffling的技術(shù), 它結(jié)合了 DNA shuffling和傳統(tǒng)的育種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 傳統(tǒng)的育種技術(shù)耗時(shí)較長,經(jīng)常由于親本的相容性不好而影響育種效果, 而且實(shí)驗(yàn)過程完全可以用隨機(jī)突變和篩選文庫來完

10、成, Zhang等從能產(chǎn)泰樂菌素的Streptomyces fradiae的改造過程中證明了這種方法可以快速改善泰樂菌素的產(chǎn)量,Ranjan Patnaik比較了傳統(tǒng)育種方法和基因組改組技術(shù)之后, 發(fā)現(xiàn)乳酸菌Lact obacillus能在pH4.0的條件下產(chǎn)出比野生菌株多三倍的乳酸,而傳統(tǒng)育種方法明顯沒有基因組改組取得的效果好。體外異源雜交和體內(nèi)修復(fù),這種方法首先在體外進(jìn)行異源雜交 DNA雙鏈, 轉(zhuǎn)化細(xì)菌, 在胞內(nèi)完成修復(fù), 同時(shí)產(chǎn)生出一種新的以親本DNA為模板的雜交 DNA文庫,這是對(duì)DNA Shuffling等已存在的基因重組方法的補(bǔ)充, 特別適用于大片段 DNA和整個(gè)操作子的重組, 但

11、是這種方法需要親本基因具有極高的同源性,而且每次重組只能進(jìn)行兩個(gè)親本,這也在一定程度上限制了它的應(yīng)用。4 -5通過同源重組或隨機(jī)突變產(chǎn)生的蛋白突變體一定程度上都是依照模板蛋白進(jìn)行的,它們與模板蛋白的相似程度較大, 而非同源重組 (Nonhomologous Recombination 能夠產(chǎn)生完全不同于模板的新的蛋白質(zhì), 新的蛋白可能在自然界中并不存在, 為研究進(jìn)化蛋白提供了潛在的可能性,很多種方法可以進(jìn)行非同源重組, 如雜交酶遞增切斷技術(shù)( Incre mental truncati on for the creation of hybrid enzymes ,I TCHY可以產(chǎn)生由基因氨基

12、端和羧基端雜交形成的嵌合體基因庫。該法首先用核酸外切酶代替DNase I分別消化兩種基因建立ITCHY庫(I TLs , 對(duì)靶序列末端基因完全刪除, 并通過降低切斷溫度、改變消化緩沖液濃度和加入酶抑制劑等方法改變外切酶在37消化過快的問題。最后將兩種 I TLs混合后進(jìn)行DNA改組建立SCRATC HY庫(shuffled I TC HY libraries。5這項(xiàng)技術(shù)降低了家族改組對(duì)同源性的要求, 使家族 DNA改組的概念和應(yīng)用得到了進(jìn)一步深化和延伸, 并在其他領(lǐng)域得到有效的運(yùn)用。Griswold等將序列同源性僅54.3%、且對(duì)底物的專一性不同的人類和大白鼠類GST酶進(jìn)行家族改組,利用I T

13、CHY技術(shù)對(duì)兩者的同源編碼基因進(jìn)行融合重組, 獲得的重組表達(dá)蛋白 SCR23活性是人類 GST酶的 300倍, 時(shí)突變體酶還獲得了催化谷胱甘肽和利尿酸結(jié)合的合成酶活性。6- 73. 展望蛋白質(zhì)工程作為分子生物學(xué)水平上對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行改造的手段已經(jīng)受到越來越多的研究人員的關(guān)注, 并且其應(yīng)用廣泛, 目前已經(jīng)在蛋白質(zhì)藥物、 工業(yè)酶制劑、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、生物代謝途徑等等研究領(lǐng)域取得了很大進(jìn)步。在分子生物學(xué)手段日益發(fā)展的今天, 新的蛋白質(zhì)工程手段逐漸面世, 對(duì)于蛋白質(zhì)分子改造起到了極其重要的作用, 通過這種手段提高蛋白質(zhì)的特性如熱穩(wěn)定性、耐酸性、耐堿性等仍然是目前的重要研究方向。83.1醫(yī)用蛋白質(zhì)工

14、程利用生物細(xì)胞因子進(jìn)行人類疾病治療的獨(dú)到作用已越來越被人們重視, 基因工程技術(shù)誕生后首先就被用于人生長激素釋放抑制因子、 胰島素等醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)品開發(fā),大大降低了用于治療的成本。 利用大腸桿菌進(jìn)行真核生物蛋白質(zhì)表達(dá)會(huì)遇到生物活性低等問題, 解決這些問題的出路一是研究開發(fā)新的表達(dá)系統(tǒng), 如酵母、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞等,這方面已取得很大的成效。 另一方面就需要借助蛋白質(zhì)工程, 如利用分子設(shè)計(jì)和定點(diǎn)突變技術(shù)獲得胰島素突變體的工作國內(nèi)外都取得了相當(dāng)多的成果, 此外, 干擾素、 尿激酶等蛋白質(zhì)工程也都取得進(jìn)展, 即將得到長效、 速效、 穩(wěn)定、 作用更廣的蛋白質(zhì)藥物。醫(yī)用蛋白質(zhì)的市場廣大, 待開發(fā)的產(chǎn)品也非常之多

15、。此外, 利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)進(jìn)行分子設(shè)計(jì), 通過肽模擬物(peptidomimetics構(gòu)象篩選藥物等方面研究更加豐富了蛋白質(zhì)工程的內(nèi)容。93.2工業(yè)用酶的蛋白質(zhì)工程以酶的固定化技術(shù)為核心的酶工程是本世紀(jì)繼生物發(fā)酵工程后又一次創(chuàng)造出巨大工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的現(xiàn)代生物工程技術(shù), 蛋白質(zhì)工程在這一領(lǐng)域應(yīng)用可以說前景最看好。通過酶的結(jié)構(gòu)或局部構(gòu)象調(diào)整、 改造, 可大大提高酶的耐高溫、 抗氧化能力, 增加酶的穩(wěn)定性和適用pH 范圍, 從而獲得性質(zhì)更穩(wěn)定、 作用效率更高的酶用于食品、化工、制革、洗滌等工業(yè)生產(chǎn)中, 這方面已取得了許多成功的先例, 如食品工業(yè)中用于制備高果糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶, 用于干酷生產(chǎn)的凝乳酶

16、, 用于洗滌工業(yè)的枯草桿菌蛋白酶等蛋白質(zhì)工程產(chǎn)品都將開發(fā)使用。103.3病毒疫苗的蛋白質(zhì)工程疫苗在病毒等病原引起的人及畜禽傳染性疾病的預(yù)防中起著不可替代的作用, 從制備疫苗的途徑來說已有幾代產(chǎn)品, 目前如乙肝等基因工程疫苗已開始得到應(yīng)用。 通過抗原移植、 構(gòu)建各種顆粒體、 活載體及多價(jià)疫苗的研究已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn), 但也遇到一些問題, 主要是移植抗原三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有完全恢復(fù)天然狀態(tài), 因而使得抗原性不夠理想。 蛋白質(zhì)工程技術(shù)將在今后的疫苗改造中發(fā)揮重要的作用, 不但可使抗原性得到最大的提高, 還可使重組疫苗抗病作用更加廣泛。 近年來越來越多的病毒精細(xì)結(jié)構(gòu)的闡明正在為開展蛋白質(zhì)工程奠定基

17、礎(chǔ)。3.4抗體的蛋白質(zhì)工程抗體不僅在哺乳動(dòng)物機(jī)體中擔(dān)負(fù)著重要的體液免疫功能, 還在醫(yī)學(xué)、 生物學(xué)免疫診斷中被廣泛地應(yīng)用。 本世紀(jì)證明了抗體是一類免疫球蛋白, 并相繼闡明了抗體產(chǎn)生及其多樣性的細(xì)胞和分子機(jī)制, 使免疫學(xué)研究成為生命科學(xué)前沿領(lǐng)域。 同時(shí)抗體的制備技術(shù)也經(jīng)歷著一次又一次革命, 由血清抗體到雜交瘤單克隆抗體, 再到基因工程抗體庫技術(shù), 可謂日新月異。單克隆抗體給人類疾病的藥物導(dǎo)向治療帶來了曙光, 但應(yīng)用上遇到鼠抗體對(duì)人具有免疫原作用的問題, 蛋白質(zhì)工程已成功用于解決這個(gè)問題。 通過結(jié)構(gòu)分析表明, 抗體可變區(qū)內(nèi)具有6 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR 起與抗原結(jié)合作用, 其它區(qū)域做為支架(FR 維持

18、構(gòu)象, 通過CDR 移植已構(gòu)建了30多種改型的人源化鼠抗, 并通過序列分析比較和計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行分子設(shè)計(jì), 對(duì)FR 區(qū)特定堿基進(jìn)行替換, 保證了改型后抗體親和力不下降, 這種抗體有人稱之為第二代基因工程抗體, 亦即蛋白質(zhì)工程抗體。可以相信, 蛋白工程在未來改造抗體中還將發(fā)揮更大作用, 目前有人研究通過抗體的多樣性從抗體庫中篩選具有酶活性的分子, 從而得到抗體酶。113.5分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究及其它以上提到的只是蛋白質(zhì)工程應(yīng)用上的幾個(gè)具有代表性的領(lǐng)域, 實(shí)際上它的作用遠(yuǎn)非如此。 隨著蛋白質(zhì)工程研究對(duì)象的擴(kuò)大和技術(shù)的成熟, 其應(yīng)用領(lǐng)域也將不斷拓寬, 除用于直接生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品外, 也將通過操作生物體內(nèi)蛋白質(zhì)而獲得特定的生物性狀。 有人根據(jù)植物葉綠體中 1,5 二磷酸核酮糖羧化酶、 加氧酶雙重活性, 提出通過蛋白質(zhì)工程途徑提高其還原能力、 降低氧化能力從而提高光合效率的設(shè)想, 目前進(jìn)行了大量探索工作, 一旦成功必將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的效益。參考文獻(xiàn)1 Roth, M and A Jeltsch , Changing t he target base specificity of the EcoRV DNA methyltrans ferase by rational de novo protein - design_2001: 3137- 31442 Cahoon