蛋白質(zhì)工程的現(xiàn)狀發(fā)展及展望

1、蛋白質(zhì)工程的現(xiàn)狀發(fā)展及展望摘要: 蛋白質(zhì)工程是用分子生物學手段對蛋白質(zhì)進行分子改造的技術。介紹了蛋白質(zhì)工程的幾種常用方法及其基本原理和研究進展。關鍵詞: 蛋白質(zhì)工程;定點誘變; 定向進化20世紀 70年代以來, 對蛋白質(zhì)的分子改造漸漸進入研究領域, 通過對蛋白質(zhì)分子進行突變, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相對活力更高的突變體,對蛋白質(zhì)的分子改造技術逐漸純熟。蛋白質(zhì)工程的主要技術分為理性進化和非理性進化,已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領域取得了較大的進展。1.理性進化理性進化主要是利用定點誘變技術, 通過在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定長度的核苷酸片段達到定點突變氨基酸殘基的目的。運

2、用該技術已有不少成功改造蛋白質(zhì)的例子。Markus Roth通過同源性比對和定點突變技術, 對 EcoR DNA甲基化酶進行改造,使其對胞嘧啶的親和性增加了22倍。定點突變還主要應用于蛋白質(zhì)結構和功能的研究方面。?；d體蛋白 (ACP的主要作用是在單不飽和脂肪酸的特定位置引入雙鍵, Caho通過定點突變研究, 發(fā)現(xiàn)將五個氨基酸殘基置換之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脫氫酶變成9- 18 : 0- ACP脫氫酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定點突變技術結合的方法將從Bacillus stear other mophilus分離出來的嗜熱菌蛋白酶突變, 得到的突變體穩(wěn)定性提

3、高了8倍, 100 在變性劑存在的情況下還能發(fā)揮作用,但是大部分單個氨基酸的改變對于整個蛋白的影響比較小,很難在高級結構上改變蛋白質(zhì)的三級結構, 從而造成很大的影響, 所以在定點突變的基礎上又出現(xiàn)了許多新的技術, 用于改造蛋白質(zhì)分子。12.非理性進化非理性蛋白質(zhì)進化, 又稱定向進化或者體外分子進化,在實驗室中模擬自然進化過程, 利用分子生物學手段在分子水平增加分子多樣性, 結合高通量篩選技術, 使在自然界中需要千百萬年才能完成的進化過程大大縮短,在短期內(nèi)得到理想的變異。這種方法不用事先了解蛋白質(zhì)結構、催化位點等性質(zhì), 而是人為地制造進化條件, 在體外對酶的編碼基因進行改造, 定向篩選, 獲得具

4、有預期特征的改良酶, 在一定程度上彌補了定點誘變技術的不足, 具有很大的實際應用價值。一個比較成功應用定向進化的例子是對紅色熒光蛋白的改造。綠色熒光蛋白由于本身獨特的發(fā)光性質(zhì),被應用到細胞生物學當中, 作為體內(nèi)原位跟蹤蛋白質(zhì)的一個極其有效的工具。Dis cosoma紅色熒光蛋白(Ds Red在熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術 (fluorescen ceresonance energy transfer中可以和綠色熒光蛋白一起作用,作為研究兩種蛋白質(zhì)相互作用的有效工具,但是野生型的Ds Red由于顯色速率較慢,而且穩(wěn)定性較差,Brooke Bevis建立隨機突變文庫,在103-105個轉(zhuǎn)化子中篩選到了大大

5、提高顯色效率的突變體, 使顯色效率提高了10-15倍。2易錯PCR是利用DNA聚合酶不具有3 5校對功能的性質(zhì), 在PCR擴增待進化酶基因的反應中, 使用低保真度的聚合酶, 改變四種dNTP的比例,加入錳離子并增加鎂離子的濃度, 使DNA聚合酶以較低的比率向目的基因中隨機引入突變, 并構建突變庫。Moore等對鼠傷寒沙門菌 Salmonella typhmiurium產(chǎn)生的門冬氨酰二肽酶(aspart yldipeptidase進行改良, 經(jīng)兩次易錯PCR引入隨機突變, 并結合 DNA改組和正向選擇篩選, 得到的pepEm3074突變株, 其酶活力比野生菌提高47倍。DNA改組( DNA sh

6、uffling技術克服了隨機突變的隨機性較大的限制,能夠直接將多條基因的有利突變直接重組到一起, 它的原理是使用DNase I酶切或超聲波斷裂多條具有一定同源關系的蛋白編碼基因, 這些小片段隨機出現(xiàn)部分片段的重疊, 產(chǎn)生的片段在不加引物的情況下進行幾輪PCR,通過隨機的自身引導或在組裝PCR過程中重新組裝成全長的基因, 由于存在不同的模板, 使得到的全長基因具有不同譜系之間的重組, 再進行最后一輪PCR,加入全長引物, 擴增得到改造過的全長基因。利用DNA改組已成功進化了編碼內(nèi)酰胺酶、葡萄糖苷酶、脂肪酶、綠色熒光蛋白、烷基轉(zhuǎn)移酶、苯甲基脂酶基因以及編碼砷酸鹽和阿特拉津降解酶的整個操縱子。3在

7、DNA改組技術的基礎上又發(fā)展出外顯子改組 (exon shuffling和家族改組(family shuffling。外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動, 而使 DNA改組不受任何限制, 發(fā)生在整個基因片段上, 更適用于真核生物,并可獲得各種大小的隨機文庫。交錯延伸重組 (stagger edextensi on process , StEP是一種簡化的 DNA shuffling方法,是在 PCR 反應中, 將含不同點突變的模板混合, 隨之進行多輪變性、 短暫復性及延伸反應, 在每一輪中, 那些部分延伸的片段可以隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸,由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的

8、重組, 如此重復直至獲得全長基因片段。RPR 法 (Random-Prmiing Recombi nation DNA Shuffling是以單鏈DNA為模板, 配合一套隨機序列引物, 先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段, 由于堿基的錯配和錯誤引發(fā), 這些短 DNA片段中也會有少量的點突變,在隨后的PCR反應中, 它們互為引物進行合成, 伴隨組合, 再組裝成完整的基因長度。過渡模板隨機嵌合(random chmiera genesis on transient templates, ACHITT技術是改進的基因改組技術, 不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯延伸反應, 而是將隨機切割的基因片段雜

9、交到一個臨時 DNA模板上進行排序、修剪、空隙填補和連接, 其中的懸垂切割步驟可使短片段得以重組,提高重組的頻率和密度。發(fā)酵過程常常由于微生物對溫度、pH、溶液的影響而導致產(chǎn)量低, 微生物的自身調(diào)控系統(tǒng)十分復雜和精細, 致使單個基因的突變很難對其產(chǎn)生某種產(chǎn)物的能力造成影響,因此, 對微生物的進化要在整個基因組的水平上進行才能起到有效的作用, 于是出現(xiàn)了一種叫全基因組改組(Whole-Genome Shuffling的技術, 它結合了 DNA shuffling和傳統(tǒng)的育種技術的優(yōu)點, 傳統(tǒng)的育種技術耗時較長,經(jīng)常由于親本的相容性不好而影響育種效果, 而且實驗過程完全可以用隨機突變和篩選文庫來完

10、成, Zhang等從能產(chǎn)泰樂菌素的Streptomyces fradiae的改造過程中證明了這種方法可以快速改善泰樂菌素的產(chǎn)量,Ranjan Patnaik比較了傳統(tǒng)育種方法和基因組改組技術之后, 發(fā)現(xiàn)乳酸菌Lact obacillus能在pH4.0的條件下產(chǎn)出比野生菌株多三倍的乳酸,而傳統(tǒng)育種方法明顯沒有基因組改組取得的效果好。體外異源雜交和體內(nèi)修復,這種方法首先在體外進行異源雜交 DNA雙鏈, 轉(zhuǎn)化細菌, 在胞內(nèi)完成修復, 同時產(chǎn)生出一種新的以親本DNA為模板的雜交 DNA文庫,這是對DNA Shuffling等已存在的基因重組方法的補充, 特別適用于大片段 DNA和整個操作子的重組, 但

11、是這種方法需要親本基因具有極高的同源性,而且每次重組只能進行兩個親本,這也在一定程度上限制了它的應用。4 -5通過同源重組或隨機突變產(chǎn)生的蛋白突變體一定程度上都是依照模板蛋白進行的,它們與模板蛋白的相似程度較大, 而非同源重組 (Nonhomologous Recombination 能夠產(chǎn)生完全不同于模板的新的蛋白質(zhì), 新的蛋白可能在自然界中并不存在, 為研究進化蛋白提供了潛在的可能性,很多種方法可以進行非同源重組, 如雜交酶遞增切斷技術( Incre mental truncati on for the creation of hybrid enzymes ,I TCHY可以產(chǎn)生由基因氨基

12、端和羧基端雜交形成的嵌合體基因庫。該法首先用核酸外切酶代替DNase I分別消化兩種基因建立ITCHY庫(I TLs , 對靶序列末端基因完全刪除, 并通過降低切斷溫度、改變消化緩沖液濃度和加入酶抑制劑等方法改變外切酶在37消化過快的問題。最后將兩種 I TLs混合后進行DNA改組建立SCRATC HY庫(shuffled I TC HY libraries。5這項技術降低了家族改組對同源性的要求, 使家族 DNA改組的概念和應用得到了進一步深化和延伸, 并在其他領域得到有效的運用。Griswold等將序列同源性僅54.3%、且對底物的專一性不同的人類和大白鼠類GST酶進行家族改組,利用I T

13、CHY技術對兩者的同源編碼基因進行融合重組, 獲得的重組表達蛋白 SCR23活性是人類 GST酶的 300倍, 時突變體酶還獲得了催化谷胱甘肽和利尿酸結合的合成酶活性。6- 73. 展望蛋白質(zhì)工程作為分子生物學水平上對蛋白質(zhì)結構和功能進行改造的手段已經(jīng)受到越來越多的研究人員的關注, 并且其應用廣泛, 目前已經(jīng)在蛋白質(zhì)藥物、 工業(yè)酶制劑、農(nóng)業(yè)生物技術、生物代謝途徑等等研究領域取得了很大進步。在分子生物學手段日益發(fā)展的今天, 新的蛋白質(zhì)工程手段逐漸面世, 對于蛋白質(zhì)分子改造起到了極其重要的作用, 通過這種手段提高蛋白質(zhì)的特性如熱穩(wěn)定性、耐酸性、耐堿性等仍然是目前的重要研究方向。83.1醫(yī)用蛋白質(zhì)工

14、程利用生物細胞因子進行人類疾病治療的獨到作用已越來越被人們重視, 基因工程技術誕生后首先就被用于人生長激素釋放抑制因子、 胰島素等醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)品開發(fā),大大降低了用于治療的成本。 利用大腸桿菌進行真核生物蛋白質(zhì)表達會遇到生物活性低等問題, 解決這些問題的出路一是研究開發(fā)新的表達系統(tǒng), 如酵母、 哺乳動物細胞等,這方面已取得很大的成效。 另一方面就需要借助蛋白質(zhì)工程, 如利用分子設計和定點突變技術獲得胰島素突變體的工作國內(nèi)外都取得了相當多的成果, 此外, 干擾素、 尿激酶等蛋白質(zhì)工程也都取得進展, 即將得到長效、 速效、 穩(wěn)定、 作用更廣的蛋白質(zhì)藥物。醫(yī)用蛋白質(zhì)的市場廣大, 待開發(fā)的產(chǎn)品也非常之多

15、。此外, 利用蛋白質(zhì)工程技術進行分子設計, 通過肽模擬物(peptidomimetics構象篩選藥物等方面研究更加豐富了蛋白質(zhì)工程的內(nèi)容。93.2工業(yè)用酶的蛋白質(zhì)工程以酶的固定化技術為核心的酶工程是本世紀繼生物發(fā)酵工程后又一次創(chuàng)造出巨大工業(yè)應用價值的現(xiàn)代生物工程技術, 蛋白質(zhì)工程在這一領域應用可以說前景最看好。通過酶的結構或局部構象調(diào)整、 改造, 可大大提高酶的耐高溫、 抗氧化能力, 增加酶的穩(wěn)定性和適用pH 范圍, 從而獲得性質(zhì)更穩(wěn)定、 作用效率更高的酶用于食品、化工、制革、洗滌等工業(yè)生產(chǎn)中, 這方面已取得了許多成功的先例, 如食品工業(yè)中用于制備高果糖漿的葡萄糖異構酶, 用于干酷生產(chǎn)的凝乳酶

16、, 用于洗滌工業(yè)的枯草桿菌蛋白酶等蛋白質(zhì)工程產(chǎn)品都將開發(fā)使用。103.3病毒疫苗的蛋白質(zhì)工程疫苗在病毒等病原引起的人及畜禽傳染性疾病的預防中起著不可替代的作用, 從制備疫苗的途徑來說已有幾代產(chǎn)品, 目前如乙肝等基因工程疫苗已開始得到應用。 通過抗原移植、 構建各種顆粒體、 活載體及多價疫苗的研究已經(jīng)成為生物技術領域的研究熱點, 但也遇到一些問題, 主要是移植抗原三級結構沒有完全恢復天然狀態(tài), 因而使得抗原性不夠理想。 蛋白質(zhì)工程技術將在今后的疫苗改造中發(fā)揮重要的作用, 不但可使抗原性得到最大的提高, 還可使重組疫苗抗病作用更加廣泛。 近年來越來越多的病毒精細結構的闡明正在為開展蛋白質(zhì)工程奠定基

17、礎。3.4抗體的蛋白質(zhì)工程抗體不僅在哺乳動物機體中擔負著重要的體液免疫功能, 還在醫(yī)學、 生物學免疫診斷中被廣泛地應用。 本世紀證明了抗體是一類免疫球蛋白, 并相繼闡明了抗體產(chǎn)生及其多樣性的細胞和分子機制, 使免疫學研究成為生命科學前沿領域。 同時抗體的制備技術也經(jīng)歷著一次又一次革命, 由血清抗體到雜交瘤單克隆抗體, 再到基因工程抗體庫技術, 可謂日新月異。單克隆抗體給人類疾病的藥物導向治療帶來了曙光, 但應用上遇到鼠抗體對人具有免疫原作用的問題, 蛋白質(zhì)工程已成功用于解決這個問題。 通過結構分析表明, 抗體可變區(qū)內(nèi)具有6 個互補決定區(qū)(CDR 起與抗原結合作用, 其它區(qū)域做為支架(FR 維持

18、構象, 通過CDR 移植已構建了30多種改型的人源化鼠抗, 并通過序列分析比較和計算機模擬進行分子設計, 對FR 區(qū)特定堿基進行替換, 保證了改型后抗體親和力不下降, 這種抗體有人稱之為第二代基因工程抗體, 亦即蛋白質(zhì)工程抗體?？梢韵嘈? 蛋白工程在未來改造抗體中還將發(fā)揮更大作用, 目前有人研究通過抗體的多樣性從抗體庫中篩選具有酶活性的分子, 從而得到抗體酶。113.5分子生物學基礎研究及其它以上提到的只是蛋白質(zhì)工程應用上的幾個具有代表性的領域, 實際上它的作用遠非如此。 隨著蛋白質(zhì)工程研究對象的擴大和技術的成熟, 其應用領域也將不斷拓寬, 除用于直接生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品外, 也將通過操作生物體內(nèi)蛋白質(zhì)而獲得特定的生物性狀。 有人根據(jù)植物葉綠體中 1,5 二磷酸核酮糖羧化酶、 加氧酶雙重活性, 提出通過蛋白質(zhì)工程途徑提高其還原能力、 降低氧化能力從而提高光合效率的設想, 目前進行了大量探索工作, 一旦成功必將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的效益。參考文獻1 Roth, M and A Jeltsch , Changing t he target base specificity of the EcoRV DNA methyltrans ferase by rational de novo protein - design_2001: 3137- 31442 Cahoon