米曲霉轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷中的甾體皂苷生成薯蕷皂苷元的工藝優(yōu)化

1、米曲霉轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷中的甾體皂苷米曲霉轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷中的甾體皂苷生成薯蕷皂苷元的工藝優(yōu)化生成薯蕷皂苷元的工藝優(yōu)化齊珊珊,董悅生,劉琳,修志龍(大連理工大學(xué) 環(huán)境與生命學(xué)院 生物科學(xué)與工程系，大連 116024)摘要：目的摘要：目的 優(yōu)化米曲霉直接轉(zhuǎn)化盾葉薯蕷藥材生成薯蕷皂苷元的工藝條件。 方法方法 從培養(yǎng)基緩沖鹽、藥材載量、微生物接種量、溫度等幾個(gè)方面對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。 結(jié)果結(jié)果的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，藥材載量為 3.33%，米曲霉接種量 8%，37培養(yǎng) 84h 后提溫至50再繼續(xù)轉(zhuǎn)化 8h，能夠達(dá)到最大的轉(zhuǎn)化率。薯蕷皂苷元的最大得率為 17.06mg/g 藥材。 結(jié)論結(jié)論 米曲

2、霉能夠?qū)⒍苋~薯蕷中的甾體皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，且轉(zhuǎn)化后總的甾體皂苷有大量釋放，可達(dá)到轉(zhuǎn)化前的 1.73 倍。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：米曲霉；盾葉薯蕷；甾體皂苷；薯蕷皂苷元Biotransformation of steroidal saponins in Dioscorea Zingiberensis C.H. Wright to diosgenin by Aspergillus oryzaeQI Shan-shan, DONG Yue-sheng, LIU Lin, XIU Zhi-long(Department of Bioscience and Biotechnology, School of E

3、nvironmental and Biological Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To optimize the process of biotransformation of steroidal saponins in Dioscorea Zingiberensis C.H. Wright to obtain diosgenin. METHODS Experiments were carried out to investi

4、gate the factors including pH of buffer solution, treatment capacity, biomass inoculation, and culture temperature. RESULTS 1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4 buffer with pH5.0 or 6.0, 3.33% raw herb in culture medium, 8% biomass inoculation, culturing at 37 for 84h, then 50 for 8h could obtain the highest d

5、iosgenin yield of 17.06mg/(g raw herb). CONCLUSION Aspergillus oryzae could transform steroidal saponins in D. Zingiberensis to diosgenin and raise total content of saponins and sapogenin 1.73 times to the original content pre-transformation.KEY WORDS: Aspergillus oryzae; Dioscorea Zingiberensis C.H

6、. Wright; steroidal saponins; diosgenin 作者簡(jiǎn)介：作者簡(jiǎn)介： 齊珊珊，女，碩士生 通訊作者通訊作者：修志龍，男，教授，博士生導(dǎo)師Tel: （0411）84706369 Email: 薯蕷皂苷元是合成甾體激素和甾體避孕藥的一種重要原料1，其本身也具有抗腫瘤等生理功能2-3。它的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是化學(xué)法，即直接酸水解的方法。但由于該方法收率不高、腐蝕設(shè)備且所排出的廢水污染較為嚴(yán)重4，近年來(lái)研究人員對(duì)其進(jìn)行了一系列的技術(shù)改造，如預(yù)發(fā)酵5、淀粉-纖維素分離6、酶解發(fā)酵7、階梯生物催化協(xié)同提取8、糖化-膜回收4等方法。改進(jìn)后的方法能夠提高產(chǎn)品收率，減少污染，但仍以酸水

7、解作為中心技術(shù)，沒(méi)有從根本上改變這種方法。微生物轉(zhuǎn)化法是改造、修飾化合物結(jié)構(gòu)的一種重要的方法，近年來(lái)在天然產(chǎn)物及藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域有重要的作用。我們對(duì)這種條件溫和且環(huán)境友好的方法進(jìn)行了初步的嘗試，且實(shí)驗(yàn)中直接對(duì)藥材進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，不需要添加額外的碳源氮源，方法簡(jiǎn)便易行。本實(shí)驗(yàn)的前期工作確定了藥材及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的甾體皂苷及苷元的結(jié)構(gòu)（其結(jié)構(gòu)如圖 1 所示） ，并對(duì)它們進(jìn)行了定量分析。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)該轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，從影響微生物培養(yǎng)與酶的生成、作用的幾個(gè)重要方面提高轉(zhuǎn)化率。圖 1 盾葉薯蕷藥材及其米曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的甾體皂苷及苷元的結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of steroi

8、dal saponins and sapogenin in D. Zingiberensis and its transformed production1 儀器與材料儀器與材料1.1 儀器與試劑高效液相色譜：Waters 600E 四元泵，紫外 2487 型雙通道檢測(cè)器。色譜條件：色譜柱為 Waters Sunfire C18反向柱 (4.6mm150mm，5m)，流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B） ，流動(dòng)相梯度為 0-14min 44-75%A，14-15min 75-91%A，15.01-32min 91%A；流速 1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 203nm；進(jìn)樣量 20l。盾葉薯蕷藥材購(gòu)自陜西

9、省寶雞市，藥材粉碎至50 目的粉末。實(shí)驗(yàn)中所用乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。1.2 菌種米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC 2436 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。2 方法方法2.1 磷酸鹽緩沖體系的選擇分別配制 pH 為 5.0、6.0、7.0、8.0 的 1/15mol/L 的 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，30ml/瓶，按照藥材載量 3.33%加入藥材，將此作為發(fā)酵培養(yǎng)基直接對(duì)藥材進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并與不加緩沖鹽的 CK 進(jìn)行對(duì)比。種子培養(yǎng)基采用不加緩沖鹽的藥材-水培養(yǎng)基。種子接種量為6%，37條件下?lián)u床培養(yǎng) 84h，搖床轉(zhuǎn)速 150rpm。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用乙醇靜置

10、提取 12h，過(guò)膜，HPLC 測(cè)定薯蕷皂苷元的含量。2.2 藥材載量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響選用 pH 為 6.0 的 1/15mol/L 的 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，發(fā)酵培養(yǎng)基藥材載量分別為1.67%、3.33%、5.00%、6.67%，按照 2.1 中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)及轉(zhuǎn)化率的測(cè)定。2.3 接種量實(shí)驗(yàn)分別對(duì) 2%、4%、6%、8%、10%的種子接種量進(jìn)行考察。發(fā)酵培養(yǎng)基藥材載量為 3.33%，緩沖液及培養(yǎng)條件同上。2.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)薯蕷皂苷元生成的影響分別在 25、30和 37條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每 12h 取樣，測(cè)定薯蕷皂苷元的含量隨時(shí)間的變化。緩沖液及培養(yǎng)條件同上。2.5 提溫

11、發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在 37條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 84h 時(shí)將溫度提高至 50。每 4 小時(shí)取樣測(cè)定。3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論3.1 磷酸鹽緩沖體系對(duì)轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果表明：在所選緩沖液體系中， （圖 2） ，苷元得率提高到對(duì)照的 4 倍多。這兩個(gè)條件下的 pH 范圍更適合于米曲霉生長(zhǎng)、產(chǎn)酶，或更加接近于糖苷酶的最適 pH 值。圖 2 不同 pH 的 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液對(duì)藥材轉(zhuǎn)化率的影響Fig 2 Effect of pH of Na2HPO4-KH2PO4 buffer on conversion rate of raw herb3.2 藥材載量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響隨著藥材載量的提高，轉(zhuǎn)化率逐漸降

12、低。當(dāng)載量達(dá)到 6.67%的時(shí)候，轉(zhuǎn)化率有明顯的下降。這可能是因?yàn)楦邼舛鹊溺摅w皂苷對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝有抑制作用。在 3.33%的藥材載量下，生產(chǎn)強(qiáng)度最高。圖 3 藥材載量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig 3 Effect of raw herb amount on transformation rate of raw herb3.3 米曲霉接種量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：8%和 10%的接種量能夠明顯提高皂苷的轉(zhuǎn)化率。這是由于接種量大時(shí)，種子液中含有大量胞外水解酶類，有利于基質(zhì)的利用。所以采用較大的接種量可縮短生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的合成提前。圖 4 米曲霉接種量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig 4 Effec

13、t of inoculation amount on transformation rate of raw herb3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)薯蕷皂苷元生成的影響由圖 5 中的薯蕷皂苷元生成曲線可知，30和 37條件下培養(yǎng)米曲霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，苷元的得率要高于 25。圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)薯蕷皂苷元生成的影響Fig 5 Effect of culture temperature on diosgenin production3.5 轉(zhuǎn)化后期提溫對(duì)轉(zhuǎn)化的影響一般糖苷酶的最適溫度通常在 42-60之間，即當(dāng)培養(yǎng)微生物至糖苷酶分泌后，提高溫度使之接近其最適溫度可以在短時(shí)間迅速提高轉(zhuǎn)化率。但若溫度過(guò)高，如超過(guò) 50，則

14、會(huì)影響到酶的穩(wěn)定性、損失酶活，因而選擇 50作為提溫后的溫度。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 5 可知，提溫 8h 后苷元得率達(dá)到了 (14.800.89) mg/g，比提溫前（84h）提高了 38.1%。若不提溫，該時(shí)間段內(nèi)苷元含量沒(méi)有顯著上升。比較藥材提取液和米曲霉轉(zhuǎn)化（提溫后）的液相圖可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)米曲霉的轉(zhuǎn)化，極性較大的皂苷已經(jīng)基本水解完全，生成了極性較小的皂苷（即長(zhǎng)糖鏈逐漸水解縮短），進(jìn)而生成苷元。 圖 6 轉(zhuǎn)化后期提溫對(duì)薯蕷皂苷元生成的影響Fig 6 Effect of temperature elevation on diosgenin production圖 7 藥材提取液和米曲霉轉(zhuǎn)化后液相圖圖

15、中：(a) 藥材直接提??； (b)米曲霉轉(zhuǎn)化后1-盾葉新苷；2-三角葉皂苷；3-葡萄糖三糖苷；4-葡萄糖二糖苷；5-延齡草次苷；6-薯蕷皂苷元Fig 7 HPLC chromatographs of extraction and biotransformation(a) direct extraction; (b) post-transformation1-zingibernsis newsaponin; 2-deltonin; 3-diosgenin-triglucoside; 4-diosgenin-diglucoside; 5-trillin; 6-diosgenin3.6 米曲霉轉(zhuǎn)化對(duì)

16、總皂苷的影響經(jīng)米曲霉轉(zhuǎn)化及升溫后，總的皂苷及苷元的含量顯著增加。尤其是升溫之后，達(dá)到117.29mol/(g 藥材)，是微波輔助提取方法的 1.73 倍，比酸水解法高了 47.4%。這是因?yàn)槊浊股L(zhǎng)的過(guò)程中，利用了藥材中的淀粉和纖維素作為碳源，也就釋放了它們所“禁錮”的甾體皂苷；同時(shí)微生物轉(zhuǎn)化的條件溫和，對(duì)薯蕷皂苷元的結(jié)構(gòu)破壞較小，因而提高了總皂苷的量。圖 8 不同方法提取或處理后總的皂苷及苷元的量A-藥材索氏提取； B-藥材微波輔助提??；C-藥材酸水解；D-米曲霉 37轉(zhuǎn)化 84h；E-米曲霉 37轉(zhuǎn)化 84h 后提溫 8hFig 7 HPLC chromatographs of extr

17、action and biotransformationA- Soxhlet extraction; B- Microwave assistant extraction; C-Acidic hydrolysis；D- 84h transformation by A. oryzae at 37; E- 84h transformation at 37, then at 50 for 8h4 結(jié)論結(jié)論通過(guò)對(duì) Na2HPO4-KH2PO4緩沖液的 pH 值、藥材載量、米曲霉接種量、溫度等因素進(jìn)行考察，確定了最佳的 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，藥材載量為 3.33%，米曲霉接種量8%，37培養(yǎng)

18、 84h 后提溫至 50再繼續(xù)轉(zhuǎn)化 8h。每克盾葉薯蕷藥材經(jīng)米曲霉轉(zhuǎn)化最多可得到 17.06mg 的薯蕷皂苷元，且轉(zhuǎn)化后總的甾體皂苷有大量釋放，可達(dá)到轉(zhuǎn)化前的 1.73 倍。微生物所產(chǎn)生的酶往往具有一定的專一性和特異性，而盾葉薯蕷中的甾體皂苷糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，涉及到多種的糖苷鍵及不同的連接方式，使得轉(zhuǎn)化的機(jī)制變得復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)為微生物轉(zhuǎn)化法獲得薯蕷皂苷元提供了可行性依據(jù)。同時(shí)也擴(kuò)展了微生物轉(zhuǎn)化在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾及獲得中間產(chǎn)物方面的應(yīng)用，說(shuō)明這種方法可以應(yīng)用于較復(fù)雜體系的實(shí)際應(yīng)用中。REFERENCES1FERNANDES P, CRUZ A, ANGELOVA B, et al. Microbial

19、 conversion of steroids compounds: recent developments J. Enzyme Microb Technol, 2003, 32:688-705.2RAJU J, BIRD R P. Diosgenin, a naturally occurring steroid saponin suppresses 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase expression and induces apoptosis in HCT-116 human colon carcinoma cells J. Cancer

20、Letters, 2007, 255:194-204.3CORBIERE C, LIAGRE B, BIANCHI A, et al. Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of diosgenin and other plant steroids, hecogenin and tigogenin, on human 1547 osteosarcoma cells J. Int J Oncol, 2003, 22:899-905.4WANG Y X, LIU H, BAO J G, et al.

21、 The saccharification-membrane retrieval-hydrolysis (SMRH) process: a novel approach for cleaner production of diosgenin derived from Dioscorea zingiberensis J. J Clean Prod, 2008, 16:1133-1137.5TANG X L, XU Z L, XIA B, et al. Optimization of spontaneous fermentation and acid hydrolysis of extractin

22、g diosgenin from the rhizome of Dioscorea zingiberensis J. Journal of Plant Resources and Environment（植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)）, 2004, 13(3):35-37.6LIU G L, LIU Z. Study on by-product starch of extracting dioscingenin from Dioscorea zingiberensis J. Shanxi chemical industry（山西化工）,2003,23(1):6-7.7HAN F M, YAO X Y,

23、CHEN Y. Study on the technics of cellulose degradation of Dioscorea Zingiberensis C.H. Wright J. Chemistry & Bioengineering（化學(xué)與生物工程）, 2004, (6):26-27.8ZHANG Y Q, WANG D Q, LI B X, et al. Extraction of diosgenin from Dioscorea Zingiberensis through stepwise biocatalysis J. Chinese traditional and

24、 herbal drugs（中草藥）, 37(5):688-691.ROO356OGlcGlc4GlcGlcRha243zi ngi bernsi s new saponi nGlcGlcGlc43GlcGlcdel t oni ndi osgeni n-t ri gl ucosi dedi osgeni n-di gl ucosi det ri l l i nR : sugar chai nGlcRha24GlcHdi osgeni n圖 1 盾葉薯蕷藥材及其米曲霉轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的甾體皂苷及苷元的結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of steroidal saponins

25、and sapogenin in D. Zingiberensis and its transformed productionCKpH5.0pH6.0pH7.0pH8.0024681012 Diosgenin (mg/g raw herb) 圖 2 不同 pH 的 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液對(duì)藥材轉(zhuǎn)化率的影響Fig 2 Effect of pH of Na2HPO4-KH2PO4 buffer on conversion rate of raw herb1.67%3.33%5.00%6.67%0.000.000.250.300.35 Transformatio

26、n rate 圖 3 藥材載量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig 3 Effect of raw herb amount on transformation rate of raw herb2%4%6%8%10%0.000.000.250.300.350.40Transformation rateInoculation amount 圖 4 米曲霉接種量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig 4 Effect of inoculation amount on transformation rate of raw herb02040608010002468101214 25 C 30 C 37 CDiosgenin (mg/g raw herb)Time (h) 圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)薯蕷皂苷元生成的影響Fig 5 Effect of culture temperature on diosgenin production0204060