Prescission蛋白酶制作及使用方法

1、Prescission蛋白酶制作及使用方法柱下酶切用酶的制作方法1L TB菌體用PBS重懸至35ml做高壓裂解，最終40ml總量。上清用流速，掛3-4ml柱子，PBS漂洗30ml。 用含有10%甘油的洗脫液洗脫，每管收集體積為2ml,只取主峰，可以粗略定量，也可以取百分之一的量在 Akta 上用上樣泵來做積分定量（參考下面的積分定量方法舉例）。也可以用分光光度計定量，一般可用稀釋20 倍定量。馬上分裝成每管，可切5ml 介質(zhì)。柱上酶切用酶的制作方法親和純化方法同柱下酶切，洗脫液不含甘油，得到10ml 左右洗脫液，濃縮10 倍，再加入10ml 含有10%甘油和2mM DTT的PBS稀釋，一共濃縮

2、三次換 buffer,每次濃縮時間一般在30分鐘以內(nèi)。最終濃縮至 10mg/ml ，濃縮 10 分鐘混勻一次。盡快分裝成每管，可切5ml 介質(zhì)。柱上酶切用酶的Q 純化制作方法親和純化方法同柱下酶切，洗脫液不含甘油，收集后加水大于三分之一。過 Q 柱， AB 液配方中含有10%甘油，8%B洗脫，50%B直接洗下后積分定量，分裝。粗略定量參考2000峰寬為，蛋白質(zhì)總量為 24mg,取了 12ml,濃度為2mg/ml ,直接分裝的話，可以用 125ul和250ul每份。積分定量方法舉例取 10ul ppase 濃縮液， 用本底緩沖液（ PBS） 稀釋到500ul， 用上樣泵做積分定量，積分體積為32

3、5mAu*ml ，可知濃縮好的蛋白質(zhì)光吸收為每毫升為，光吸收為1,濃縮好的蛋白質(zhì)濃度為ml, 一共24mg蛋白。表達1. 取-80度保存的質(zhì)粒pGEX-PPase?；疊L21 （DE3）感受態(tài)，涂布，37度孵箱培養(yǎng)1216 h。2. 挑取單克隆到50ml LBA培養(yǎng)基37度培養(yǎng)12-15小時。3. 1%接種到1L TBA中，培養(yǎng)3小時，4度水浴降溫，加終濃度為 0.2mM的IPTG度誘導(dǎo)培養(yǎng)18小 時。4. 4000rpm離心20分鐘收菌。加入 PBSE （1mM EDTA）至終體積 30-40ml重懸。純化1 高壓裂解2-3 次。2 萬轉(zhuǎn)離心30 分鐘，留上清。3 PBS笄衡5ml的GST柱

4、，上木PBS疆洗，4c放置過夜，等RNA降解，再用含有10%甘油和% Tween20 的酶切 buffer 漂洗干凈。洗脫用含10%甘油的還原性谷胱甘肽溶液，2ml 每管收集，取峰尖3*。4 上樣泵灌鹽酸胍再生柱子，重力流灌水，灌20%乙醇，4保存柱子。酶切效率確定5ul, 10ul, 20ul酶切PH35C蛋白3-4天，電泳檢測酶切產(chǎn)物，全部切開了。估計10ul過夜酶切1L的培養(yǎng)產(chǎn)物足夠，下次實驗再做驗證。保存用PCR管，分裝50ul每管，凍存于-80度。使用谷胱甘肽洗脫的融合蛋白，加入 1份PPase,混勻后4度過夜酶切。緩沖液1 . 10*PBSS （歐蒙基礎(chǔ)）配方：5包PBS粉劑（歐蒙

5、），加入360ml 5M NaCl,定容到500ml, 4c保存。2 500ml 2M Tris（）， 500ml 2M Tris（）350ml水溶解121.1g Tris堿，加轉(zhuǎn)子攪拌或振蕩下溶解（需要10分鐘左右），加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，抽濾后4 保存。如溫度升高，可加入預(yù)冷的水降溫，溫度下降 1度pH升高。約需鹽酸160 ml,約需鹽酸70 ml,約 需60ml,約需42ml,約需40ml。Tris緩沖液稀釋10倍pH下降，故如稀釋為 20mM使用，則pH下降。3 1L 2M Tris不調(diào) pH800ml水溶解242.2g Tris堿，加轉(zhuǎn)子攪拌，定容至 1L,抽濾后4c保存。4 50

6、0ml 0.5 mM EDTA將93.05g二水乙二胺四乙酸二鈉加入400ml水中，加入氫氧化鈉顆粒調(diào)節(jié)pH （約需10g氫氧化鈉顆粒） ，先加入7g 左右，用攪拌棒徹底攪勻，在轉(zhuǎn)子攪拌下，使其大部分溶解，靜置一會兒，使氣泡排出，并觀察沉淀量。再繼續(xù)攪拌，少量加入氫氧化鈉顆粒，觀察pH 變化，勿使其變化過快，完全溶解后，加入 4 預(yù)冷的水 （此時 pH 升高） ， 繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 為， 最終定容至1L， 抽濾除去雜質(zhì)，避光保存于4。5 10% Tween 202ml Tween 20,溶于20ml水，避光保存，千分之一稀釋使用（根據(jù)GE資料）。6 250ml 20* 酶切 buffer 儲存液4

7、00mM Tris-HCl (pH , 3 M NaCl, 20 mM EDTA配方：2M Tris-HCL50 ml5M NaCL150 ml0.5M EDTA10 ml工作液成分(2M Tris 稀釋 100 倍使用，pH 值會下降)20mM Tris-HCl， 150mM NaCl, 1 mM EDTA作為漂洗液，使用前添加% Triton X100 （或者Tween20）,做為酶切液使用前添加 % Triton （或者Tween20）和 1mM DTT。7 100ml 20 X還原性谷胱甘肽儲液成分：200mM 還原型谷胱甘肽，50mM NaCl, 1mM EDTA, % Triton

8、 X-100 （用歐蒙 Tween20 替代）， 100mM Tris（）50ml 離心管 1 支，稱取6.14g 還原型谷胱甘肽，加20ml 5M NaCl ， 4ml 0.5M EDTA，10% Tween20再加水溶解至50ml,倒入100ml燒杯，再量取50ml 2M Tris （）,倒入100ml燒杯，攪拌溶解，濾器過濾至50ml 離心管，1ml 分裝凍存于-20 度。8 500ml 7M 鹽酸胍稱取334.4g鹽酸月瓜，加水到 450ml。定容，抽濾，室溫保存。PPase信息1 . PPase是人類鼻病毒蛋白酶 Human rhinovirus B從11號氨基酸(G PNTEFAL

9、SLLR ), N端接入為BamH,尾端為EcoR。所用載體為 pGEX4t2 . pGEX4t-HR14載體表達蛋白質(zhì)序列MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNML GGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVL YMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSGGGPNTEFAL

10、SLLRKNI MTITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVD ATLVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYF VEKQ3 蛋白質(zhì)參數(shù)Number of amino acids: 410Molecular weight:Theoretical pI:Ext. coefficient Abs % （=1 g/l） Ext. coefficientAbs % （=1

11、g/l）49195, assuming all pairs of Cys residues form cystines48820, assuming all Cys residues are reduced 1L LB， OD 左右誘導(dǎo)，收菌。緩沖液配制：1M的Tris稀釋50倍（稀釋10倍下降），上純化儀，溫度為度， pH為，25度測pH值應(yīng)該是1M的Tris稀釋50倍，上純化儀，溫度為度， pH為，25度測pH值應(yīng)該是，所以酶切 buffer可以用這 個緩沖液稀釋而成。二者混合后，pH 為，溫度升高1 度，下降，所以如果25 度測的話，應(yīng)該下降，pH 值為 裂解 Buffer ：40 mL

12、 of 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT at pH .純化方法：4度30分鐘之內(nèi)，緩緩?入1ml 10% PEI, 2萬轉(zhuǎn)離心，上清上GST柱，用谷胱甘肽洗脫，用PPase Buffer（添加10%甘油）透析，濃縮到10 mg/ml ，然后分裝，10 ul 相當于 mg 的酶可以切2ml 介質(zhì)。如果濃縮到 1 mg/ml ， 100 ul 分裝即可。500ml 酶切 buffer 配方I .21g Tris-HCl, 15ml 5 M NaCl, 1ml 500 mM EDTA, 調(diào)節(jié) pH ， 500ul 1M DTT 使用時添加20*酶切 buffe

13、r 配方：400mM Tris-HCl （pH , 3 M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mM dithiothreitol（DTT 可以使用時添加）100ml 配方（調(diào)pH 到）2M Tris-HCL 20 ml5M NaCL60 ml0.5M EDTA 4 mlII 儲存液配方（調(diào)pH 到）2M Tris-HCL 200 ml5M NaCL600 ml0.5M EDTA40 ml10*酶切 buffer 配方（用1M Tis ） ：100ml 配方（不需要調(diào)pH）1M Tris-HCL 20 ml5M NaCL30 ml0.5M EDTA 2 ml500 儲存液配方（不需要調(diào)p

14、H）1M Tris-HCL100 ml5M NaCL150 ml0.5M EDTA10 mlSource: Comes from Human Rhinovirus HRV3c Protease. This is a cysteine protease.Our version of this protease is an N-terminal His-GST- dual-tagged version that runs 47KDa on SDS-PAGE.Can be removed by either GST- or Ni-affinity resins (WARNING: Need to r

15、emove DTT prior to Ni-resin use).Recognition site:LEVLFQ/GP is the standard site in most pGex vectors. Alternative sites can be cleaved.LE-R-LFQ/GP/=cleaved siteP4=Val Ala or Thr.Standard Buffer:20mM TRIS pH=150mM NaCl1mM DTT or 5-10mM BME (TCEPT not tested)0.5mM EDTA (optional)Buffer: pH ranges fro

16、m to seem optimalTemperature: 4c is optimal but this enzyme will work at room temperature (4-15C).Salt: 30-500mM NaCl have been tested with no changes in proteolysis.Reducing agent: Required. Need 1mM DTT or 5-10mM BME (TCEP has not been tested). Not to exceed2mM DTT.EDTA: (0 to 10mM) Often required

17、 to minimize metal poisoning of this enzyme (ie Ni+2 off Ni-column mayform adducts in presence of DTT). First dialyze against cleavage buffer +0.5mM EDTA prior to addition of protease.Detergents (Triton X-100, Tween-20, NP-40, Nonidet) 0 - 1% (v/v).Cleavage in solution1. Following elution of the GST

18、fusion protein from Glutathione Sepharose, dialyze the eluate extensively against Cleavage Buffer in order to remove reduced glutathione from the sample.-Note: Alternatively, sample may be adjusted to 1X Cleavage Buffer by addition of the appropriate volume of10X Cleavage Buffer.2. Add 1 l (2 units)

19、 of PreScission Protease for each 100科 g of fusion protein in the eluate. If the amountfusion protein in the elua te has not been determined, add 40科 l (80 units) of PreScission Protease for each mlof Glutathione Sepharose bed volume* from which the fusion protein was eluted. Incubate at 5 C for 4 h

20、ours.*3. Once digestion is complete, apply the sample to washed and equilibrated Glutathione Sepharose to remove the GST portion of the fusion protein and the PreScission Protease from the protein of interest. Detailed instructions for the purification of GST fusion proteins are provided in the GST

21、Purification Modules (from GE 27-4570-01,-02,-03) or the GST Gene Fusion Manual, available on-line (GE Healthsciences).*Bed volume is equal to the volume of a 50% Glutathione Sepharose slurry used or the volume of the original Glutathione Sepharose slurry supplied in the Bulk GST Purification Module

22、. RediPack columns contain a 2 ml bed volume. MicroSpin columns have a 50科 l bed volume.*More rapid cleavage may be achieved by adding a greater amount of PreScission Protease.Note: Digestion may be improved by adding TritonTM X-100, TweenTM 20, NonidetTM, or NP40 to a concentration of %. Concentrat

23、ions of these detergents up to 1% do not inhibit PreScission Protease.During cleavage reactions, it is recommended that samples be removed at various time points and analyzed by SDS-PAGHo estimate the yield, purity, and extent of digestion. The amount of PreScission Protease, temperature and length

24、of incubation required for complete digestion of a given GST fusion partner may vary depending on the fusion partner. Optimal conditions for each fusion should be determined in pilot experiments.Substrate recognition and cleavage are likely to be dependent not only upon primary structural signals, but also upon the secondary and tertiary structures of the fusion p