口服脊髓灰質(zhì)炎活疫苗制造及檢定規(guī)程

1、口服脊髓灰質(zhì)炎活疫苗制造及檢定規(guī)程口服脊髓灰質(zhì)炎活疫苗系用具有高度抗原性的脊髓灰質(zhì)炎、型減毒株，分別接種于猴腎或人二倍體細胞培養(yǎng)制成的單價或三價液體疫苗。用于預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎。A、猴腎細胞脊髓灰質(zhì)炎活疫苗1毒種1.1毒種來源可用Sabin株，Sabin純化株，中17，中2株。所有疫苗生產(chǎn)用毒株均須經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。1.2毒種批毒種批用原毒株在猴腎細胞或人二倍體細胞上制備。從原毒株算起，Sabin、型、中17及中2型傳代次數(shù)均不得超過3代，Sabin型不超過2代。所有毒種均應(yīng)于-60以下保存。每一毒種批均按A3項分批檢定（滴度不得低于6.5LogPFU/1.0ml）。2疫苗制備生產(chǎn)用房應(yīng)為獨立的單元，

2、不得攜入或操作強毒株或其他病毒、致病菌。生產(chǎn)前，應(yīng)對生產(chǎn)區(qū)進行消毒。工作人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，身體健康，并服用脊髓灰質(zhì)炎活疫苗。每年生產(chǎn)前應(yīng)進行體檢。傳染性肝炎、痢疾、活動性肺結(jié)核患者不得進入生產(chǎn)部門。在猴區(qū)工作的人員不得患有肺結(jié)核。2.1猴腎細胞制備用未做過其他試驗或做過本疫苗檢定的健康獼猴制備細胞培養(yǎng)物。所用動物隔離檢疫應(yīng)不少于6周，應(yīng)無結(jié)核、B病毒感染及其他急性傳染病。凡有嚴(yán)重化膿灶、贅生物以及明顯的肝、腎病理改變者不得用于制備疫苗。采用電磁攪拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散劑消化猴腎細胞。細胞培養(yǎng)瓶置370.5培養(yǎng)，應(yīng)于9天內(nèi)長成單層。每只猴所獲細胞為一個細胞批?？砂言锬I細胞連續(xù)傳5

3、代后，用于接種病毒。2.2病毒接種、培育與收集細胞維持液含3.05.0g/L碳酸氫鈉（pH7.67.8）。病毒接種量為0.010.5MOI，種毒后置330.5培養(yǎng)，出現(xiàn)完全病變時間應(yīng)在4096小時。病毒液按細胞批收集于大瓶中，澄清過濾。2.3病毒液合并或濃縮病毒液合并或濃縮時可用0.2m的濾膜過濾。2.4加氯化鎂與分批病毒液加氯化鎂，最終濃度為1mol/L（pH6.87.2）即為液體疫苗。同日制備的病毒液為一個亞批，數(shù)個亞批組成一個疫苗批，批量一般不超過40萬ml。2.5分裝半成品經(jīng)檢定合格后分裝即為液體疫苗成品。3檢定3.1猴腎細胞外源因子檢查于接種病毒當(dāng)天（0天），每批猴腎細胞留取10%2

4、5%換維持液，作為正常細胞對照，以檢查外源因子。該細胞瓶置3335培育，觀察14天，以此期間檢查細胞病變。有疑似病毒存在者，用猴腎細胞傳代，傳代后仍有類似現(xiàn)象，該細胞批所制疫苗應(yīng)廢棄。用于傳代的猴腎細胞應(yīng)設(shè)細胞對照。種毒后7天，檢查對照細胞中血吸附病毒。通常用0.2%0.5%雞、豚鼠紅細胞（儲存于28不超過7天），分別放48、202530分鐘觀察結(jié)果，應(yīng)為陰性。如血吸附可疑陽性，在同種細胞上繼續(xù)盲傳，如傳出病毒，該批細胞制備的疫苗應(yīng)予廢棄。當(dāng)日生產(chǎn)猴腎細胞批同時接種小方瓶數(shù)個做外源因子檢查，于種毒02天，將細胞上清混合液接種于對SV40病毒敏感的Vero細胞瓶中，混合液在培養(yǎng)液中的含量應(yīng)不少于

5、20%，同種細胞最少留一瓶以上不接種，作為細胞對照，觀察14天。于接種后58天，再把上述細胞培養(yǎng)的上清液盲傳一代，傳代后觀察14天。3.2病毒液檢查樣品以脊髓灰質(zhì)炎病毒型特異性抗體（該抗體不能用猴制備，免疫用抗原必須用非靈長類細胞制備）或單克隆抗體中和。中和物（可稀釋，但稀釋度不應(yīng)超過14）接種猴腎細胞或其他已知對SV40敏感的細胞，并留取正常細胞對照，37培養(yǎng)觀察4周。觀察到2周時，用同樣細胞再傳一代，并觀察2周。觀察期滿因其他原因剔除不能觀察的細胞瓶數(shù)不大于20%，本試驗為成立。如培養(yǎng)物發(fā)生病變，應(yīng)查清原因。如證實該病變是由于未中和的脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的則須重試。如證實病變確系SV40或其

6、他外源因子污染所致，并證明與病毒液有關(guān)，則該批病毒液應(yīng)廢棄。按生物制品無菌試驗規(guī)程進行。支原體檢查使用已證實支持需固醇和非需固醇支原體生長的液體和固體兩種培養(yǎng)基。用微量細胞病變法或空斑法在猴腎或Hep-2或其他敏感細胞上進行。培養(yǎng)溫度為3536，病變法7天判定結(jié)果，空斑法4天判定結(jié)果。病毒滴定時應(yīng)設(shè)病毒參考品。取、型單價或三價脊髓灰質(zhì)炎病毒抗血清與等量樣品混合，置37中和1小時，接種猴腎、Hep-2或其他敏感細胞，7天判定結(jié)果。樣品應(yīng)為單價病毒液，型別正確無誤。樣品應(yīng)進行獼猴皰疹病毒（B病毒）和其他病毒檢查。用體重為1.52.5kg的健康家兔最少5只，每只家兔注射的樣品量不少于10ml，用其中

7、1ml進行皮內(nèi)多點注射，其余的進行皮下注射，觀察時間不少于3周。到期動物死亡數(shù)不得超過20%。無B病毒和其他病毒感染判為合格。家兔在試驗24小時以后死亡，疑有B病毒感染時作尸體解剖檢查，取部分神經(jīng)組織及臟器標(biāo)本凍存待查。同時用腦細胞制成10%懸液，以同樣方法接種5只家兔，證實有B病毒感染時，應(yīng)終止生產(chǎn)并報告國家檢定當(dāng)局，未采取措施防止再感染之前，不得繼續(xù)生產(chǎn)。（1）猴的數(shù)量疫苗猴體試驗必須設(shè)立參考制品。評價、型疫苗及其參考制品最少應(yīng)各有11只有效猴，評價型疫苗應(yīng)至少有18只有效猴。數(shù)個亞批疫苗可合并作一個疫苗批進行猴體試驗，疫苗量一般不超過40萬ml。猴子的大小和性別應(yīng)承受機分配各組。同型參考

8、制品可用于測試一批以上疫苗。有效猴系指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)看到脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的特異性神經(jīng)元損傷的猴子。有效猴數(shù)不足時，允許補足，但也應(yīng)同時設(shè)有參考猴數(shù)。如試驗需要2個工作日，則每一個工作日用疫苗和同型參考制品接種的猴子數(shù)應(yīng)相等。為了得到11只和18只有效猴，通常要相應(yīng)地增加接種猴數(shù)。（2）疫苗和參考制品的病毒滴度疫苗和同型參考制品的病毒含量應(yīng)調(diào)整到盡可能接近，每只猴注射6.57.5LogCCID50/1.0ml，但只用一個病毒濃度接種動物。（3）試驗觀察全部猴子應(yīng)觀察1722天。在接種24小時后死亡猴應(yīng)作尸體解剖，檢查是否因脊髓灰質(zhì)炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定時可以剔除。在觀察期內(nèi)死

9、亡的猴數(shù)不超過20%時，試驗為成立。呈瀕死狀態(tài)或嚴(yán)重麻痹的猴子應(yīng)處死進行尸檢。（4）檢查切片數(shù)每只猴子取中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行組織學(xué)檢查。切片厚度為1015m，沒食子藍染色檢查切片數(shù)如下：腰膨大12個切面；頸膨大10個切面；延髓2個切面；橋腦和小腦各1個切面；中腦1個切面；大腦皮層左右側(cè)和丘腦各1個切面。（5）病毒活性的計分為了評價腦和脊髓半個切面的病毒活性，由同一人員統(tǒng)一采用4級計分法判斷其病變嚴(yán)重程度。（一）僅有細胞浸潤（這不足以認(rèn)為是有效猴）；（二）細胞浸潤伴有少量的神經(jīng)元損害；（三）細胞浸潤伴有廣泛的神經(jīng)元損害；（四）大量的神經(jīng)元損害，伴有或無細胞浸潤。切片中有神經(jīng)元損害，但未見針跡者應(yīng)視為

10、有效猴。切片中由外傷引起的損害，而又無特異的病理改變則不視為有效猴。嚴(yán)重程度的分值是由腰髓、頸髓和腦組織切片的整個切片的計分累計而成的。每只有效猴的病變分值為：Ls=腰髓分值總和/半個切片數(shù)+頸髓分值總和/半個切片數(shù)+腦分值總和/半個切片數(shù)3再計算每組有效猴的平均分值。（6）神經(jīng)毒力試驗的評價。參考制品的平均病變分值在上限與下限之間時，各生產(chǎn)單位才能根據(jù)各自的C1、C2、C3值判定疫苗合格與否，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：疫苗的平均病變分值（Xtest）與參考制品的平均病變分值（Xref）想比較。合格：Xtest-XrefC1不合格：Xtest-xrefC2重試：（1）C1Xrest-XrefC2（僅限一次

11、）；（2）同一次試驗中，疫苗組平均分值與參考組平均分值之差小于C1時，而疫苗組中單只猴最高分值2.5，并大于疫苗參考組單只猴最高分值的兩倍時，本批疫苗應(yīng)重試。重試合格：X（test1+test2）-X（ref1+ref2）/2C3重試不合格：X（test1+test2）-X（ref1+ref2）/2C3取健康猴20只，麻醉后在兩側(cè)視丘分別注入0.5ml樣品，不低于7.0LogPFU/1.0ml及10-1各10只，觀察21天。到期動物死亡數(shù)和未命中數(shù)不得超過20%，否則應(yīng)補足。注射后48小時內(nèi)死亡或出現(xiàn)非特異性麻痹癥狀者剔除不計。中途死亡及到期處死動物，做中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查，判定標(biāo)準(zhǔn)如下

12、：合格標(biāo)準(zhǔn)：凡符合下列情況之一判為合格：（1）中樞神經(jīng)系統(tǒng)無脊髓灰質(zhì)炎病理組織學(xué)改變；（2）有2只猴發(fā)生輕度及其以下病變；（3）1只猴發(fā)生中度及其以下病變。不合格標(biāo)準(zhǔn)：（1）一只猴有中度病變，同時一只猴有輕度以上病變者；（2）一只猴有重度以上病變者。重試標(biāo)準(zhǔn)：2個亞批疫苗合并試驗結(jié)果不合格者，可以分批重試，并按上述標(biāo)準(zhǔn)判定。將單價病毒液分別在36及40溫度條件下進行病毒滴定，培養(yǎng)溫度差不超過0.1，試驗設(shè)t+和t-樣品（生產(chǎn)毒種或已知對人安全的疫苗）為對照。如果被試病毒液和參考病毒在36的繁殖滴度比40的滴度高5.0Log，則rct特征試驗合格。此外，也可進行d特征試驗，以彌補rct特征試驗的

13、不足。3.3成品檢定疫苗應(yīng)為橘紅色液體，澄清無異物。按生物制品無菌試驗規(guī)程進行。疫苗批樣品于37放置48小時，病毒滴度降低不得超過0.5Log。4保存與效期于-20以下保存，自病毒滴定合格之日起效期為2年。28保存效期為1年。B、人二倍體細胞脊髓灰質(zhì)炎活疫苗1毒種與A1項相同。2細胞2.1細胞株用于疫苗生產(chǎn)的人二倍體細胞株必須不含外源因子，核型正常，對病毒敏感?？捎肒MB-17、2BS等株。所用細胞株須經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。2.2原始細胞種子批一個細胞種子批，應(yīng)有足夠量的早世代細胞，分裝安瓿保存于液氮中。2.3生產(chǎn)用細胞種子批用一個或多個安瓿細胞種子，傳代繁殖到適宜世代，具有一定量的均一細胞，分裝安瓿

14、，凍存于液氮中。2.4生產(chǎn)用細胞種子批檢定按人二倍體細胞建株、檢定及制備疫苗規(guī)程要求進行。3疫苗制備3.1細胞培養(yǎng)從生產(chǎn)用細胞種子開始培養(yǎng)，以適宜分種率連續(xù)傳代，直至累積足夠量的細胞培養(yǎng)物。用于生產(chǎn)的細胞代次應(yīng)在整個生命周期的前2/3代次內(nèi)。3.2病毒接種、培養(yǎng)與收集與A2.2項相同。3.3病毒液合并與A2.3項相同。3.4加氯化鎂與分批與A2.4項相同。3.5分裝與A2.5項相同。4檢定4.1生產(chǎn)用人二倍體細胞外源因子檢查于種毒當(dāng)天，每批細胞留取2%5%不種毒，換液作為正常細胞對照，以檢查外源因子。從接種之日起，觀察2周，其形態(tài)不應(yīng)有改變。于種毒02天，對照細胞上清液接種原代幼兔腎、非人靈長

15、類傳代細胞及另一株人二倍體細胞。接種的樣品量應(yīng)占維持液的20%以上，觀察14天。種毒后58天用上述細胞盲傳一代，傳代后觀察14天，應(yīng)無細胞病變。在種毒時，用0.5%雞、豚鼠混合紅細胞在48和2025做血吸附試驗，檢查對照細胞。4.2細胞鑒別試驗在生產(chǎn)用細胞水平世代或其后數(shù)代，作中期細胞染色體檢查，粗?jǐn)?shù)300個細胞，細數(shù)100個細胞，其核型應(yīng)正常。以鑒別確為生產(chǎn)用細胞無誤。4.3病毒液檢定樣品以脊髓灰質(zhì)炎病毒型特異性抗體（非人源抗體，該抗體不能用猴制備，免疫用的抗原不能用生產(chǎn)用的細胞制備）或單克隆抗體中和，中和物（可稀釋，但稀釋度不應(yīng)超過14）接種對麻疹病毒敏感的細胞和另一株人二倍體細胞，并留取正常細胞對照，37培養(yǎng)觀察2周。觀察期間由于非特異原因廢棄的細胞瓶數(shù)應(yīng)少于20%。如發(fā)生任何因外源因子引起的細胞病變，則該批病毒液應(yīng)廢棄。4.4成品檢定與A3.3項相同。5保存與效期與4項相同?？诜顾杌屹|(zhì)炎活疫苗使用說明書口服脊髓灰質(zhì)炎活疫苗系用具有高度免疫原性的脊髓灰質(zhì)炎、型減毒株，分別接種于猴腎或人二倍體細胞培養(yǎng)制成的單價或三價液體疫苗。用于預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎（又稱小兒麻痹癥）。（一）三價活疫