氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油中的主要脂肪酸

1、氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油中的主要脂肪酸摘要：以 5 個(gè)沙棘（ Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）品種的果實(shí)為試材，建立氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油主要脂肪酸成分的方法。 果肉油和種子油采用氯仿-甲醇法提取， 甲醇鈉 -甲醇法甲酯化衍生后進(jìn)行定性和定量。結(jié)果表明，十九烷酸甲酯是氣相色譜法測(cè)定沙棘果實(shí)中脂肪酸成分含量的理想內(nèi)標(biāo)物。果肉油和種子油中的主要脂肪酸為棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和 -亞麻酸。果肉油中棕櫚油酸（ 36.25%）和棕櫚油酸（ 28.92%）含量高， -亞麻酸含量低；種子油中亞油酸（ 33.65%）和 -亞麻酸（32.95%）

2、含量高，棕櫚油酸含量低。 5 個(gè)品種沙棘的果肉油和種子油中主要脂肪酸的組成及含量存在一定的差異。亞歷山大 12 號(hào)果肉油中的脂肪酸含量最高，為 84.84 g/100 g 油；無(wú)刺豐種子油中的脂肪酸含量最高， 為 88.39 g/100 g 油。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適合沙棘油脂樣品中脂肪酸的定量測(cè)定。關(guān)鍵詞：沙棘（ Hippopha ？ ?c rhamnoides L. ）；果肉油；種子油；脂肪酸；內(nèi)標(biāo)法；定量分析中圖分類號(hào)： S793.6；O657.7+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 0439-8114（ 2017）09-1734-05DOI：Sea Buckthorn by

3、GC Internal Standard Method YANG Ming-xuan， ZHOU Yang， LU Jun，LI He（ College of Environment and Resources， Dalian MinzuUniversity ， Dalian 116600， Liaoning， China） Abstract ： A gas chromatographic method fordetermination of fatty acids in pulp oil and seed oil was established with five cultivars of

4、sea buckthorn berries as materials. The pulp oil and seed oil were extracted using chloroform-methanol method. The qualitative and quantitative analysis of fatty acids in oils were performed after they were methylated with CH3ONa-CH3OH. The results showed that methyl nonadecylate was optimal interna

5、l standard to analyse the contents of fatty acids in pulp oil and seed oil from sea buckthorn. The main fatty acids included palmitic ， palmitoleic ，stearic， oleic， linoleic and -linolenic acids. In pulp oil ， the contents of palmitoleic acid （36.25%） and palmitic acid（ 28.92%） were high and -linole

6、nic acid was few. In seed oil ，the contents of linoleic acid （ 33.65%） and -linolenic acid（ 32.95%） were high and palmitoleic acid was few. There were some differences in composition and content of main fattyacids among five cultivars. The pulp oil from Yalishanda-12 exhibited the highest content of

7、 total fatty acids at 84.84 g/100 g oil， respectively. The seed oil from Wucifeng contained highest total fatty acids at 88.39 g/100 g oil. The method is simple ， effective and accurate for the fatty acid determination of sea buckthorn oil samples.Key words：sea buckthorn（Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）

8、；pulp oil ；seed oil； fatty acid ； internal standard method ； quantitative analysis沙棘（Hippopha ？ ?c rhamnoides L.）又名酸刺、 醋柳等，胡?j 子科沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱，鹽堿，是中國(guó)重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)植物 1 。沙棘的果肉、種子和葉都含有油，即果肉油、種子油、葉油，其含油量受到基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、成熟時(shí)期等影響。通常所說(shuō)的沙棘油主要指果肉油和種子油，二者富含不飽和脂肪酸，例如果肉油中有較多的棕櫚油酸、油酸，種子油中的亞油酸和亞麻酸較多2， 3。沙棘油經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，作

9、為藥用原料，廣泛用于治療燒傷、燙傷、凍傷等，對(duì)扁桃體炎、口腔炎、結(jié)膜炎等都有顯著療效，另外它還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，對(duì)于心、腦血管系統(tǒng)疾病以及腫瘤、癌癥等有預(yù)防作用4，5。沙棘油中的脂肪酸組成及含量是衡量果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外針對(duì)沙棘油脂肪酸含量的檢測(cè)主要集中于脂肪酸組分相對(duì)含量的測(cè)定6-8 ，而脂肪酸絕對(duì)含量測(cè)定的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)在進(jìn)行內(nèi)標(biāo)物的選擇和色譜條件的優(yōu)化之后，建立了氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定沙棘果肉油和種子油中脂肪酸的方法，促進(jìn)了沙棘種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和綜合開(kāi)發(fā)利用。1 材料與方法1.1 材料供試的 5 個(gè)沙棘品種（壯圓黃、無(wú)刺豐、柳沙1 號(hào)、西伯利亞紅暈、亞歷山大 12 號(hào)）的成熟果實(shí)于

10、 2013 年 7 月采自遼寧省阜新沙棘良種選育研究所（ E121° 28， N42°26），-50 長(zhǎng)期保存。1.2 主要試劑、儀器37 種脂肪酸甲酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯和十九烷酸甲酯的分析標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自 Sigma-Aldrich（中國(guó)）公司，色譜純級(jí)，純度 99%；氯仿、甲醇和正己烷購(gòu)自美國(guó)Heonywell Burdick& Jackson 公司，均為色譜純級(jí)，純度 99%；甲醇鈉，氯化鉀為分析純，購(gòu)自生工生物工程上海（股份）有限公司。GC-2010 型氣相色譜儀及工作站（日本SHIMADZU）；Labcon

11、co 低溫冷凍濃縮機(jī)（美國(guó)Labconco）； Mettler ToledoAB135-S型電子分析天平 （瑞士Mettler Toledo ）；XW-80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。1.3 方法果肉油及種子油提取取適量冷凍保存的沙棘果實(shí)真空凍干4 d（ 11 Pa，-53 ）。凍干后的果實(shí)放入研缽中，取出種子（自然風(fēng)干后保存） ，倒入液氮快速研磨至粉末狀，再次真空干燥1 d（ 11 Pa， -53 ），取出后 -20 保存。果肉油的提?。喝? g 果肉粉末于50 mL 離心管中，加入 10 mL 甲醇攪拌混勻1 min，再加入20 mL 氯仿攪拌混勻2min ，徹底混勻后過(guò)濾，

12、殘?jiān)?0 mL 的氯仿-甲醇（2 1，V/V）重新懸浮，混勻后過(guò)濾， 殘?jiān)?10 mL 的氯仿 -甲醇（ 21，V/V）再懸浮，混勻過(guò)濾， 收集濾液，加入 1/4 體積的 0.88%的 KCl，搖勻靜置， 分層后除去上層， 對(duì)下層用 1/4 體積的甲醇-水（ 1 1，V/V）洗滌，移去上層重復(fù)上一步驟，移去上層，將下層過(guò)濾，濾液于 -20 保存。種子油的提?。喝?1 g 風(fēng)干種子，經(jīng)液氮研磨成粉末，移到 50 mL 離心管內(nèi)，余下步驟與果肉油提取方法相同。樣品的甲酯化 準(zhǔn)確量取 500 L 上述樣品，參考Christie9 的方法，采用甲醇鈉-甲醇法對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化處理。分析前向甲酯化的樣

13、品中加入5001 000 L 含有1mg/mL十九烷酸甲酯的正己烷，充分溶解后經(jīng)0.45 mL濾膜過(guò)濾待測(cè)。色譜條件色譜柱： Agilent-DB23 色譜柱（60 m×0.25 mm ×0.25 m）；柱箱：90 ；SPL1（進(jìn)樣口）：250 ；載氣：高純氮?dú)?；柱流量?0.8 mL/min ； FID2（檢測(cè)器）：270 ；分流比 301，進(jìn)樣量 1 L。柱箱升溫程序：初始溫度為 90 ，以 9 /min 的速度升溫至 190 ，再以 3 /min 的速度升溫至 215 ，保持 10 min ，再以 3 /min 的速度升溫至 230 保持 5 min ，最后以 3 /

14、min 的速度升溫至 245 保持 5 min 。混標(biāo)的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定稱取適量棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、 硬脂酸甲酯、 油酸甲酯、 亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品， 用含有 1 mg/mL 十九烷酸甲酯的正己烷溶液分別配制成 5、 5、 2、 4、5、 5 mg/mL 的 6 種脂肪酸甲酯儲(chǔ)備液。按表1 的濃度梯度，取適當(dāng)體積的每種儲(chǔ)備液，用含有濃度為1 mg/mL 正己烷（ 190）的溶液定容， 配制 8組脂肪酸甲酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品（混標(biāo)）。根據(jù)果肉和種子中脂肪酸的組成特點(diǎn)，選擇適合的濃度范圍，應(yīng)用GCsolution 工作站內(nèi)標(biāo)法制定每種脂肪酸甲酯相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析按上述色譜條件

15、，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和峰面積對(duì)樣品進(jìn)行定性定量。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。2 結(jié)果與分析2.1 色譜條件的確定及內(nèi)標(biāo)物的選擇圖 1 是 37 種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜情況，在該色譜條件下， 37 種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品顯示出較好的分離效果，其出峰時(shí)間在 6 45 min 之內(nèi)，可用于待測(cè)沙棘油中脂肪酸成分的定性。如圖 2 和圖 3 所示，沙棘果肉油和種子油中所有的脂肪酸甲酯顯示出較好的分離效果和較高的信號(hào)響應(yīng)，與37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)的出峰時(shí)間一致性高。利用GCsolution 軟件將樣品的總離子流與 37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)的色譜圖進(jìn)行比對(duì)后定性

16、。根據(jù)出峰時(shí)間、峰高和峰面積可判斷，沙棘果肉油和種子油中的主要脂肪酸包括棕櫚酸（C16： 0）、棕櫚油酸（ C16： 1）、硬脂酸（ C18：0）、油酸（ C18： 1c）、亞油酸（ C18：2c）和 -亞麻酸（C18：3n3）6?N，集中在 2030 min被分離，但它們?cè)诠庥秃头N子油中的組成有所不同。植物油脂中脂肪酸的定量常以十五烷酸及其甲酯、十七烷酸及其甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，也有用十三烷酸及其甲酯作為內(nèi)標(biāo)物。但由圖 2 和圖 3 可見(jiàn)，上面提到的內(nèi)標(biāo)物不適于本試驗(yàn)。在柳沙 1 號(hào)沙棘的果肉油和種子油中，均檢測(cè)出了十五烷酸（ 15： 0）和十七烷酸（ C17：0），前者在果肉油和種子油中為微量

17、，出峰時(shí)間大約在 19 min ；后者在果肉油中含量稍高，種子油中為痕量，出峰時(shí)間大約在22 min 。另外，沙棘果肉和種子中的主要脂肪酸為16 碳和 18 碳脂肪酸，出峰時(shí)間集中在20 30 min ，十三烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間距離這一范圍較遠(yuǎn)，不是理想的內(nèi)標(biāo)物。圖4 為供試樣品不加十九烷酸甲酯和加入十九烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物的對(duì)比色譜。十九烷酸甲酯的出峰時(shí)間在被測(cè)物出峰范圍之內(nèi)，且與被檢測(cè)物分離效果明顯，不與已知脂肪酸甲酯反應(yīng)，可以有效起到內(nèi)標(biāo)物的作用，表明其是理想的脂肪酸定量的內(nèi)標(biāo)物。因此本試驗(yàn)選擇沙棘果肉油和種子油中均未檢測(cè)到的十九烷酸甲酯作為脂肪酸定量所用內(nèi)標(biāo)物。本研究首次建立了以十

18、九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)的氣相色譜法測(cè)定沙棘油脂肪酸的方法，為沙棘油脂肪酸的絕對(duì)含量提供了有效的方法，有助于沙棘油脂肪酸的精確檢測(cè)和深度開(kāi)發(fā)。參考文獻(xiàn)：1 RUAN C J，RUMPUNEN K， NYBOM H. Advances inimprovement of quality and resistance in a multipurpose crop ： Sea buckthornJ.Critical Reviews in Biotechnology ， 2013， 33： 126-144.2 張哲民 .沙棘果油與籽油內(nèi)含物之若干比較 J.國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)， 2007， 5（ 3）： 1-4.

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