中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)課件

1、中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥研究常用中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)米麗華米麗華生物教研室生物教研室中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù) 教學(xué)參考資料教學(xué)參考資料n唐炳華、王繼峰唐炳華、王繼峰: :醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)( (第一版）第一版）, ,中國中醫(yī)藥中國中醫(yī)藥出版社出版社,2006,2006年年n胡維新胡維新: :醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（第一版）醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（第一版）, ,科學(xué)出版社科學(xué)出版社,2007,2007年年nT.A.Brown著，魏群等譯：著，魏群等譯：基因克隆和基因克隆和DNADNA分析（第五版），分析（第五版），高等教育出版社，高等教育出版社，20032003年年

2、n王艷明、周坤福、徐力：王艷明、周坤福、徐力：分子生物學(xué)與中醫(yī)藥研究分子生物學(xué)與中醫(yī)藥研究，上海，上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，中醫(yī)藥大學(xué)出版社，20002000年年nRobert F. Weaver Robert F. Weaver ： Molecular BiologyMolecular Biology（3 3rdrd ed ed ），）， McGraw-Hill Press.2005McGraw-Hill Press.2005n 美美J.J.薩姆布魯克薩姆布魯克 D.W.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯：拉塞爾著，黃培堂等譯：分子克分子克隆實驗指南（第三版），隆實驗指南（第三版），科學(xué)出版社，科學(xué)出

3、版社，20022002年年n朱玉賢、李毅、鄭曉峰：朱玉賢、李毅、鄭曉峰：現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版），現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版），高高等教育出版社，等教育出版社，2007年年中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù) 教學(xué)參考資料教學(xué)參考資料n盧圣棟：盧圣棟：現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)，高等教育出，高等教育出版社，版社，19931993年年nJ.D.Watson et al Molecular Biology of the Gene 5th The Benjamin /Cummings Publishing Company,Inc.2003nLewin, B., GENES . Universi

4、ty Press, Oxford. 2004n孫乃恩孫乃恩 孫東旭孫東旭 朱德煦：朱德煦：分子遺傳學(xué)分子遺傳學(xué)（第二版），（第二版），南京大學(xué)出版社，南京大學(xué)出版社，19971997年年n網(wǎng)址：（參見教材網(wǎng)址：（參見教材P274表表7-3）中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)第一章第一章 緒論緒論一、分子生物學(xué)的含義一、分子生物學(xué)的含義n廣義上，分子生物學(xué)是從分子水平研究生命廣義上，分子生物學(xué)是從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動及其規(guī)律的一門現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動及其規(guī)律的一門生命學(xué)科。生命學(xué)科。n狹義上，分子生物學(xué)是一門在分子水平上研狹義上，分子生物學(xué)是一門在分子水平上研究基因結(jié)構(gòu)和功能的

5、學(xué)科。究基因結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。n分子生物學(xué)源自遺傳學(xué)和生物化學(xué)，它以分子生物學(xué)源自遺傳學(xué)和生物化學(xué)，它以核核酸和蛋白質(zhì)酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象 。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)第一章第一章 緒論緒論一、什么是分子生物學(xué)一、什么是分子生物學(xué)n分子生物學(xué)已廣泛滲分子生物學(xué)已廣泛滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論基礎(chǔ)。的理論基礎(chǔ)。微生物學(xué)微生物學(xué)臨床臨床各學(xué)科各學(xué)科細細 胞學(xué)胞學(xué)免疫學(xué)免疫學(xué)病理學(xué)病理學(xué)藥理學(xué)藥理學(xué)生生 理學(xué)理學(xué)分分 子子生物學(xué)

6、生物學(xué)中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容（一）分子生物學(xué)理論（一）分子生物學(xué)理論1 1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能能 。分子遺傳學(xué)（分子遺傳學(xué)（moleculargeneticsmoleculargenetics）是是其主要研究內(nèi)容其主要研究內(nèi)容包括核酸包括核酸/ /基因組的結(jié)構(gòu)，基因組的結(jié)構(gòu)， 遺傳信息的復(fù)制，遺傳信息的復(fù)制， 轉(zhuǎn)錄與翻譯，轉(zhuǎn)錄與翻譯， 核核酸存儲的信息突變與修復(fù)，酸存儲的信息突變與修復(fù)， 基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用等。等。

7、n遺傳信息傳遞的遺傳信息傳遞的中心法則（中心法則（centraldogmacentraldogma）是其理論體系的核心。是其理論體系的核心。 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容（一）分子生物學(xué)理論：（一）分子生物學(xué)理論：1 1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能能 。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)n研究研究執(zhí)行各種生命功能的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與執(zhí)行各種生命功能的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能功能 。3 3、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)：研究細胞內(nèi)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)：研究細胞內(nèi)

8、、細胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。細胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。n信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理的研究在理論和技術(shù)方面與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理的研究在理論和技術(shù)方面與上述核酸及蛋白質(zhì)分子有著緊密的聯(lián)系，上述核酸及蛋白質(zhì)分子有著緊密的聯(lián)系，是當前分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一。是當前分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一。二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（二）（二） 分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)1、基本技術(shù)基本技術(shù)n分光光度技術(shù)；電泳技術(shù)（分光光度技術(shù)；電泳技術(shù)（瓊脂糖凝膠電泳，醋瓊脂糖凝膠電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電酸纖維素薄膜電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，聚

9、焦，噬菌體的限制性內(nèi)切酶酶切片段噬菌體的限制性內(nèi)切酶酶切片段）；）；n放射性同位素技術(shù)；放射性同位素技術(shù)；n色譜技術(shù)（色譜技術(shù)（層析法，吸附色譜法，分配色譜法，層析法，吸附色譜法，分配色譜法，離子交換色譜法，凝膠色譜法，親和色譜法，高離子交換色譜法，凝膠色譜法，親和色譜法，高效液相色譜法效液相色譜法）；n細胞培養(yǎng)等細胞培養(yǎng)等二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（二）（二） 分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)2 2、核酸操作技術(shù)、核酸操作技術(shù)n核酸的提取和純化；核酸的提取和純化；nDNADNA、RNARNA合成技術(shù)；合成技術(shù)；nDNADNA重組技術(shù)；重組

10、技術(shù)；n核酸雜交技術(shù)；核酸雜交技術(shù)；nDNADNA序列測定技術(shù)等。序列測定技術(shù)等。3 3、實用蛋白技術(shù)、實用蛋白技術(shù)n蛋白質(zhì)的提取和純化蛋白質(zhì)的提取和純化 ；n蛋白質(zhì)測定；蛋白質(zhì)測定；n蛋白質(zhì)印跡技術(shù)；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)；n蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)等。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)等。二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)中的兩項最重要的實驗技術(shù)分子生物學(xué)中的兩項最重要的實驗技術(shù) 分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展中的瓶頸分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展中的瓶頸 n基因克?。ɑ蚩寺。―NA重組，基因工程）重組，基因工程） (Gene clone, DNA recombinatio

11、n, gene engineering) 基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) vector DNA操作工具酶的發(fā)現(xiàn)操作工具酶的發(fā)現(xiàn) DNA manipulation 基因合成和基因測序基因合成和基因測序 sequencenPCR技術(shù)技術(shù) ( polymerase chain reaction)中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（三）分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（三）分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用n如癌的分子生物學(xué)；如癌的分子生物學(xué)；n免疫分子生物學(xué)；免疫分子生物學(xué)；n人類基因分析；人類基因分析；n基因產(chǎn)物的醫(yī)學(xué)用途；基因產(chǎn)物的醫(yī)學(xué)用途；n新藥的發(fā)現(xiàn)；新藥的發(fā)現(xiàn)；n基因診斷、治療；基因診斷、治療；n人類疾病的

12、分子生物學(xué)等。人類疾病的分子生物學(xué)等。二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)三、分子生物學(xué)的發(fā)展簡史（一）準備和醞釀階段（一）準備和醞釀階段n19世紀后期到世紀后期到20世紀世紀50年代初，是現(xiàn)代分子生物年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點學(xué)誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點對生命本質(zhì)的認識上的重大突破：對生命本質(zhì)的認識上的重大突破： 1、確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)、確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2、確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是、確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNAn1944年年O.T.Avery等證明了肺炎

13、球菌轉(zhuǎn)化因子是等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA n1952年年A.D.Hershey和和M.Cha-se用用DNA35S和和32P分別標記分別標記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸 ,證明遺傳物質(zhì)證明遺傳物質(zhì)是是DNA。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段n這一階段是從這一階段是從50年代初到年代初到70年代初，以年代初，以1953年年Watson和和Crick提出的提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展

14、的黃金時代。本理論建立和發(fā)展的黃金時代。 1、中心法則的建立、中心法則的建立nWatson和和Crick就提出就提出DNA復(fù)制的可能模型復(fù)制的可能模型 。n1956年年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶聚合酶 。n1958年年Meselson及及Stahl用同位素標記和超速離心用同位素標記和超速離心分離實驗為分離實驗為DNA半保留模型提出了證明半保留模型提出了證明 。n1968年年Okazaki（岡畸）提出（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型不連續(xù)復(fù)制模型 。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段n1972年證實了年證實了

15、DNA復(fù)制開始需要復(fù)制開始需要RNA作為引物作為引物 n1958年年Weiss及及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的的RNA聚合酶聚合酶 n1961年年Hall和和Spiege-lman用用RNA-DNA雜交證明雜交證明mRNA與與DNA序列互補序列互補 n60年代年代Nirenberg、Ochoa以及以及Khorana等幾組科等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼傳密碼 n1970年年Temin和和Baltimore又同時從雞肉瘤病毒顆又同時從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶的

16、反轉(zhuǎn)錄酶 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)2、對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進一步認識、對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進一步認識n1956-58年年Anfinsen和和White根據(jù)對酶蛋白的變根據(jù)對酶蛋白的變性和復(fù)性實驗，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由性和復(fù)性實驗，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的。其氨基酸序列來確定的。 n1958年年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個氨基酸殘基的差別有一個氨基酸殘基的差別 n1969年年Weber開始應(yīng)用開始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電聚丙烯酰

17、胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量泳測定蛋白質(zhì)分子量 n1973年氨基酸序列自動測定儀問世。年氨基酸序列自動測定儀問世。 n中國科學(xué)家在中國科學(xué)家在1965年人工合成了牛胰島素年人工合成了牛胰島素 。n在在1973年用年用1.8AX-線衍射分析法測定了牛胰島素線衍射分析法測定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)，為認識蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)做出了重要貢的空間結(jié)構(gòu)，為認識蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)做出了重要貢獻。獻。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)（三）初步認識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入（三）初步認識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段發(fā)展階段n7070年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標志著人

18、類深入認識生命本質(zhì)并能動改造生碑，標志著人類深入認識生命本質(zhì)并能動改造生命的新時期開始。其間的重大成就包括：命的新時期開始。其間的重大成就包括： 1 1、重組、重組DNADNA技術(shù)的建立和發(fā)展技術(shù)的建立和發(fā)展 n1967-19701967-1970年年R.YuanR.Yuan和和H.O.SmithH.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；n19721972年年BergBerg等將等將SV-40SV-40病毒病毒DNADNA與噬菌體與噬菌體P22DNAP22DNA在在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來在真核細體外重組

19、成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來在真核細胞中合成的蛋白質(zhì)能在細菌中合成胞中合成的蛋白質(zhì)能在細菌中合成, ,打破了種屬界打破了種屬界限；限； 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)1 1、重組、重組DNADNA技術(shù)的建立和發(fā)展技術(shù)的建立和發(fā)展n1977年年Boyer等首先將人工合成的生長激等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽肽 n1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。島素。 中醫(yī)藥

20、研究常用分子生物學(xué)技術(shù)1 1、重組、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展技術(shù)的建立和發(fā)展n我國已有人干擾素、人白介素我國已有人干擾素、人白介素2、人集落刺激因、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進入生產(chǎn)或臨床試苗等多種基因工程藥物和疫苗進入生產(chǎn)或臨床試用用 。n1982年年P(guān)almiter等將克隆的生長激素基因?qū)胄〉葘⒖寺〉纳L激素基因?qū)胄∈笫芫鸭毎藘?nèi)，培育得到比原小鼠個體大幾鼠受精卵細胞核內(nèi)，培育得到比原小鼠個體大幾倍的倍的“巨鼠巨鼠” 。n1991年美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺年美國向一患先天性免

21、疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入重組的基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入重組的ADA基因，獲得成功。基因，獲得成功。 n1994年我國用導(dǎo)入人凝血因子年我國用導(dǎo)入人凝血因子基因的方法成功基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。治療了乙型血友病的患者。 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)1 1、重組、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展技術(shù)的建立和發(fā)展n這時期基因工程的迅速進步得益于許多分這時期基因工程的迅速進步得益于許多分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。 n1975-1977年年Sanger、Maxam和和Gilbert先后發(fā)明了三種先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測定法

22、；序列的快速測定法； n1985年年Cetus公司公司Mullis等發(fā)明的聚合酶等發(fā)明的聚合酶鏈式反應(yīng)（鏈式反應(yīng)（PCR）的特定核酸序列擴增技）的特定核酸序列擴增技術(shù)；術(shù)；n 90年代全自動核酸序列測定儀的問世年代全自動核酸序列測定儀的問世。 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)2、分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展、分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展n癌基因的發(fā)現(xiàn)癌基因的發(fā)現(xiàn)n基因診斷基因診斷n基因組文庫的建立基因組文庫的建立n基因工程生產(chǎn)人胰島素基因工程生產(chǎn)人胰島素n轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物n人類基因治療人類基因治療n基因工程抗體技術(shù)的建立和發(fā)展基因工程抗體技術(shù)的建立和發(fā)展nDNADNA芯片技術(shù)（基因芯片、生物芯片）

23、芯片技術(shù)（基因芯片、生物芯片）中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)3、基因組研究的發(fā)展、基因組研究的發(fā)展n1977年年Sanger測定了測定了X174-DNA全部全部5375個核苷酸的序列個核苷酸的序列； n1978年年Fiers等測出等測出SV-40DNA全部全部5224對對堿基序列堿基序列； n20世紀世紀80年代年代噬菌體噬菌體DNA全部全部48,502堿堿基對基對的序列全部測出；的序列全部測出； n1996年底許多科學(xué)家共同努力測出了年底許多科學(xué)家共同努力測出了大腸大腸桿菌基因組桿菌基因組DNA的全序列長的全序列長4x106堿基對堿基對。 n19902003年人類基因組計劃年人類基因組計劃（H

24、umanGenomeProject）實施并基本完）實施并基本完成成 。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)4、基因表達調(diào)控機理基因表達調(diào)控機理 n1961年，年，Jacob，F(xiàn).和和Monod，J.提出了操縱子提出了操縱子模型，模型，打開了人類認識基因表達調(diào)控的窗口。打開了人類認識基因表達調(diào)控的窗口。n20世紀世紀70年代以后才逐漸認識了真核基因組結(jié)構(gòu)年代以后才逐漸認識了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。和調(diào)控的復(fù)雜性。 n1977年最先發(fā)現(xiàn)猴年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋病毒和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的 ，揭開了認識真核基揭開了認識真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕

25、。因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。 n1981年年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的自我剪接，從的自我剪接，從而發(fā)現(xiàn)核酶（而發(fā)現(xiàn)核酶（ribozyme）。）。 n 20世紀世紀80-90年代，使人們逐步認識到真核基因年代，使人們逐步認識到真核基因的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識別與相互作用是基因表達調(diào)控根本所間的分子識別與相互作用是基因表達調(diào)控根本所在在。 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)5、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理研究的深入、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理研究的深入n1957Sutheland1957Sutheland年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)cAMPcAMP、19651

26、965年提出第二信使年提出第二信使學(xué)說，是人們認識受體介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第學(xué)說，是人們認識受體介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個里程碑。一個里程碑。n 19771977年年RossRoss等用重組實驗證實等用重組實驗證實G G蛋白的存在和功蛋白的存在和功能，深化了對能，深化了對G G蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認識。蛋白偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認識。 n 2020世紀世紀7070年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的

27、探索等，使近探索等，使近1010年來細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了年來細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了長足的進步。長足的進步。 n目前，對于某些細胞中的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)目前，對于某些細胞中的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)有了初步的認識有了初步的認識 。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)6、小分子、小分子RNA研究進展研究進展n19931993年，年，Lee RCLee RC等發(fā)現(xiàn)線蟲（等發(fā)現(xiàn)線蟲（C.elegans）lin-4基因基因編碼的長度為編碼的長度為2261b的小分子的小分子RNA關(guān)閉線蟲關(guān)閉線蟲不同發(fā)不同發(fā)育階段育階段mRNA轉(zhuǎn)錄的作用轉(zhuǎn)錄的作用 ，這是繼核酶以后，內(nèi)源，這是繼核酶以后，內(nèi)源性性RNA參與基因

28、調(diào)節(jié)的又一證據(jù)參與基因調(diào)節(jié)的又一證據(jù)。n 小分子小分子RNA(miRNARNA(miRNA或或siRNAsiRNA）具有調(diào)控基因表達的）具有調(diào)控基因表達的功能。功能。 miRNAmiRNA可以通過部分互補結(jié)合到目的可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNAmRNA的的33非翻譯區(qū)，抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘非翻譯區(qū)，抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)目的導(dǎo)目的mRNAmRNA的降解。的降解。siRNAsiRNA能誘導(dǎo)細胞內(nèi)基因沉默，能誘導(dǎo)細胞內(nèi)基因沉默，與長雙鏈與長雙鏈RNARNA有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA被降解，從而抑制被降解，從而抑制基因的表達。基因的表達。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)

29、技術(shù)n結(jié)構(gòu)生物學(xué)（結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Structural Biology） 生物大分子的高級三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一生物大分子的高級三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一 生物大分子之間的互作生物大分子之間的互作 基因的社會學(xué)基因的社會學(xué)n分子發(fā)育生物學(xué)（分子發(fā)育生物學(xué)（Molecular Developing Biology）n基因表達，基因互作基因表達，基因互作 器官發(fā)生器官發(fā)生胚胎形成胚胎形成個體發(fā)育個體發(fā)育中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)21世紀生命科學(xué)發(fā)展的重要態(tài)勢世紀生命科學(xué)發(fā)展的重要態(tài)勢n對生命現(xiàn)象的認識從單基因水平向全基因?qū)ιF(xiàn)象的認識從單基因水平向全基因組整體水平發(fā)展組整體水平發(fā)展n現(xiàn)代生命科學(xué)研究的理論

30、與技術(shù)從較長期現(xiàn)代生命科學(xué)研究的理論與技術(shù)從較長期的積累走向應(yīng)用的積累走向應(yīng)用中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)四、分子生物學(xué)與其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科的關(guān)系四、分子生物學(xué)與其他醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)學(xué)科的關(guān)系n生物化學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者同在我國教委與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切。兩者同在我國教委和科委頒布的一個二級學(xué)科中，稱為和科委頒布的一個二級學(xué)科中，稱為“生物化學(xué)與分子生生物化學(xué)與分子生物學(xué)物學(xué)” 。n生物化學(xué)主要從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象，它著重研究生物生物化學(xué)主要從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象，它著重研究生物體內(nèi)各種分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化和新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的體內(nèi)各種分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化和新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的主

31、要內(nèi)容是各種物質(zhì)代謝。主要內(nèi)容是各種物質(zhì)代謝。n分子生物學(xué)則著重闡明核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、分子生物學(xué)則著重闡明核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因表達調(diào)控的機制。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因表達調(diào)控的機制。n細胞生物學(xué)細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切。與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切。n遺傳學(xué)遺傳學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系密切。與分子生物學(xué)關(guān)系密切。n由于分子生物學(xué)涉及認識生命的本質(zhì)，它也就自然廣泛的由于分子生物學(xué)涉及認識生命的本質(zhì)，它也就自然廣泛的滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域中，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)。滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域中，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)。 n生理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理

32、學(xué)、藥理學(xué)以及臨床各生理學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)以及臨床各學(xué)科學(xué)科，分子生物學(xué)都正在廣泛地形成交叉與滲透。，分子生物學(xué)都正在廣泛地形成交叉與滲透。 中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用1、證本質(zhì)的研究、證本質(zhì)的研究n近年來運用分子生物學(xué)技術(shù)對腎的實質(zhì)、活血化瘀理論及中藥抗衰老機理進行近年來運用分子生物學(xué)技術(shù)對腎的實質(zhì)、活血化瘀理論及中藥抗衰老機理進行研究研究n例例沈自尹等采用沈自尹等采用RT-PCR法進行了法進行了“補腎健脾活血三類復(fù)方對下丘腦補腎健脾

33、活血三類復(fù)方對下丘腦-垂體垂體-腎上腺腎上腺-胸腺軸及促腎上腺激素釋放因子（胸腺軸及促腎上腺激素釋放因子（CRF）基因表達的影）基因表達的影響響”的研究，其目的是從分子水平來闡述藥物對腎陽虛證的主要調(diào)節(jié)的研究，其目的是從分子水平來闡述藥物對腎陽虛證的主要調(diào)節(jié)點。點。n例陳可冀等應(yīng)用斑點印跡雜交、原位雜交、和例陳可冀等應(yīng)用斑點印跡雜交、原位雜交、和3H-TdR3H-TdR摻入細胞摻入細胞DNADNA等等技術(shù)，證明活血化瘀類中藥都可抑制血管壁血小板衍化生長因子技術(shù)，證明活血化瘀類中藥都可抑制血管壁血小板衍化生長因子（PDGFPDGF）基因及血管壁原癌基因）基因及血管壁原癌基因c-myc mRNAc

34、-myc mRNA的表達水平，從而抑制動的表達水平，從而抑制動脈平滑肌細胞增生，阻止動脈粥樣硬化。脈平滑肌細胞增生，阻止動脈粥樣硬化。n研究表明，活血化瘀類中藥干預(yù)基因調(diào)控、抑制原癌基因表達。研究表明，活血化瘀類中藥干預(yù)基因調(diào)控、抑制原癌基因表達。n例沈小珩采用分子生物學(xué)技術(shù)對二仙湯及其拆方影響老年大鼠肝組例沈小珩采用分子生物學(xué)技術(shù)對二仙湯及其拆方影響老年大鼠肝組織超氧化物岐化酶（織超氧化物岐化酶（SODSOD）和過氧化氫酶（）和過氧化氫酶（CATCAT）活性及其基因表達水）活性及其基因表達水平的觀察發(fā)現(xiàn)，老年大鼠氧化脂質(zhì)（平的觀察發(fā)現(xiàn)，老年大鼠氧化脂質(zhì)（LPOLPO）含量明顯提高，超氧化物岐

35、）含量明顯提高，超氧化物岐化酶（化酶（SODSOD）和過氧化氫酶（）和過氧化氫酶（CATCAT）活性降低，而且與這類編碼這類酶）活性降低，而且與這類編碼這類酶的基因表達水平密切相關(guān)，用二仙湯及其拆方治療后，大鼠氧化脂質(zhì)的基因表達水平密切相關(guān)，用二仙湯及其拆方治療后，大鼠氧化脂質(zhì)（LPOLPO）含量明顯降低，提高了超氧化物岐化酶（）含量明顯降低，提高了超氧化物岐化酶（SODSOD）和過氧化氫酶）和過氧化氫酶（CATCAT）的活性。）的活性。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研

36、究中的應(yīng)用n2、治則治法的研究、治則治法的研究n科研人員用抑癌扶正行氣活血法治療經(jīng)二科研人員用抑癌扶正行氣活血法治療經(jīng)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠，采用乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差異顯示技術(shù)）和（差異顯示技術(shù)）和Northern bolt對治療對治療后大鼠肝組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌組織若后大鼠肝組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌組織若干癌基因轉(zhuǎn)錄水平降低。（見干癌基因轉(zhuǎn)錄水平降低。（見P8）中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用（二）在中醫(yī)臨床上的應(yīng)用（二）在中醫(yī)臨床上的應(yīng)用n吳志奎等進行了吳志奎等進行了“補腎生血方對補腎生血

37、方對- -地中海貧血基地中海貧血基因水平的影響因水平的影響”的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補腎生血藥的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補腎生血藥能明顯提高能明顯提高- -地中海貧血患者血紅蛋白（地中海貧血患者血紅蛋白（HbHb）和）和抗堿血紅蛋白（抗堿血紅蛋白（HbFHbF），提高血紅蛋白的珠蛋白鏈），提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比。起作用機制可能是補腎生血藥能提高珠蛋白比。起作用機制可能是補腎生血藥能提高珠蛋白鏈鏈/ /+ +比值，促進比值，促進- -珠蛋白基因的表達，誘珠蛋白基因的表達，誘導(dǎo)導(dǎo)HbFHbF合成，從而代償了合成，從而代償了- -珠蛋白基因功能缺陷。珠蛋白基因功能缺陷。中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)五、分子生物學(xué)

38、技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用n（三）在針灸研究中的應(yīng)用（三）在針灸研究中的應(yīng)用n1、針刺鎮(zhèn)痛與、針刺鎮(zhèn)痛與C-fos、C-jun、CC-k基因的研究基因的研究n2、耳針與表皮生長因子、耳針與表皮生長因子RACTH的研究的研究n3、電針抗癇與、電針抗癇與CCK基因表達的研究基因表達的研究n4、電針與抗腦缺血與、電針與抗腦缺血與C-fos原癌基因表達的研究原癌基因表達的研究n5、針刺抑制老年大鼠與垂體細胞因子基因表達、針刺抑制老年大鼠與垂體細胞因子基因表達n6、電針對細胞凋亡的影響、電針對細胞凋亡的影響n7、針刺對脊髓背角內(nèi)生長期相關(guān)蛋白、針刺對脊髓背角內(nèi)生長期相

39、關(guān)蛋白GAP43表達的影響表達的影響n8、針刺對雌性大鼠垂體雌激素受體、針刺對雌性大鼠垂體雌激素受體mRNA表達和血雌二表達和血雌二醇（醇（E2）水平影響的研究）水平影響的研究n9、“醒腦開竅醒腦開竅”針法對實驗性腦梗死大鼠腦細胞核糖核針法對實驗性腦梗死大鼠腦細胞核糖核酸的影響酸的影響中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)n（四）在中藥研究中的應(yīng)用（四）在中藥研究中的應(yīng)用n1、鑒定中藥材及藥用植物資源保護鑒定中藥材及藥用植物資源保護n常用常用DNA分子標記法，其是指以分子標記法，其是指以DNA多態(tài)性為基多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標記。礎(chǔ)的遺傳標記。 nDNA分子遺傳標記常用的方法是分子遺傳標記常用的方法是RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA隨機引物擴增隨機引物擴增多態(tài)多態(tài)DNA)是是1990年由