植物組織特異性啟動(dòng)子研究

1、收稿日期:2007-05-25外源基因在細(xì)胞中表達(dá)是基因工程研究的關(guān)鍵,而外源基因的表達(dá)首先取決于其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)。高等植物基因的表達(dá)具有時(shí)間和空間性。組織特異性啟動(dòng)子亦稱器官特異性啟動(dòng)子,在這類啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下,基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位,并表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)等特性。組織特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號(hào)為基礎(chǔ),與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有一定的共同點(diǎn)。組織特異性啟動(dòng)子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累,增加區(qū)域表達(dá)量,同時(shí)也可以避免植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。作為基因工程中最富有前景的調(diào)控元件,組織特異性啟動(dòng)子已成為近年研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)植物組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行分類和比較,

2、概述其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能及研究進(jìn)展。1營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)啟動(dòng)子1.1葉片特異表達(dá)啟動(dòng)子(green tissue specific pro-moter 葉片作為植物光合作用的器官,在能量的固定和利用中起著十分重要的作用。許多葉特異表達(dá)的基因產(chǎn)物都參與了光合過(guò)程,因此研究葉特異表達(dá)啟動(dòng)子對(duì)相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。楊予濤等采用接頭PCR 技術(shù)克隆了PNZIP 基因啟動(dòng)子,證明在葉片組織中全長(zhǎng)PNZIP 啟動(dòng)子活性比35S 啟動(dòng)子高9倍,發(fā)現(xiàn)PNZIP啟動(dòng)子中存在2個(gè)可能與光合組織特異表達(dá)有關(guān)的新的順式作用元件1,王利軍等克隆了擬南芥atslA 基因啟動(dòng)子2。另外,在玉米中發(fā)現(xiàn)的

3、C4PdK 基因的啟動(dòng)子也具有葉肉和葉舌的組織特異性3。1.2韌皮部特異表達(dá)啟動(dòng)子(phloeom specific pro-moter 韌皮部負(fù)責(zé)植物體內(nèi)有機(jī)物的運(yùn)輸,是植物維管組織的一部分,也是許多植物病蟲害的直接侵害目標(biāo),對(duì)這類啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的研究將為植物基因工程的研究提供啟動(dòng)元件。蔣浩等首次證明筍瓜PP2基因啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)外源基因在異源植物韌皮部及分生組織中特異性表達(dá)4。另一種韌皮部特異表達(dá)基因是楊樹的樹皮儲(chǔ)藏蛋白BSP (bark storageprotein ,蔣浩初步證明楊樹BSP 基因啟動(dòng)子有韌皮部表達(dá)特性,可介導(dǎo)GUS 基因在轉(zhuǎn)基因煙草韌皮部特異表達(dá)5。除高等植物中已發(fā)現(xiàn)的重

4、要的啟植物組織特異性啟動(dòng)子研究宋揚(yáng)周軍會(huì)張永強(qiáng)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081摘要:組織特異性啟動(dòng)子可以調(diào)控基因在某些特定的器官或組織部位中表達(dá)。通過(guò)對(duì)植物組織特異性啟動(dòng)子進(jìn)行分類和比較,概述了植物組織特異性啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能及研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞:組織特異性啟動(dòng)子順式作用元件植物基因工程Research on Plant Tissue-specific PromotersSong Yang Zhou Junhui Zhang Yongqiang(Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural

5、Sciences ,Beijing 100081Abstract :Tissue specific promoter can control gene expression in certain organ or tissue.In this paper ,structuralcharacters ,function of promoters and recent advances of studies are reviewed by categorizing and comparing with the plant tissue specific promoters.Key words :T

6、issue specific promoterCis-acting elementPlant genetic engineering生物技術(shù)通報(bào)BIOTECHNOLOGY BULLETIN綜述與專論2007年第6期生物技術(shù)通報(bào)Biotechnology Bulletin2007年第6期動(dòng)子外,韌皮部特異表達(dá)啟動(dòng)子還包括:水稻東格魯桿狀病毒(RTBV啟動(dòng)子、竹節(jié)花黃斑駁病毒(CoYMV啟動(dòng)子、椰子腐葉病毒(CFDV啟動(dòng)子、玉米蔗糖合酶-1(Sh基因啟動(dòng)子、油菜伸展蛋白基因啟動(dòng)子、發(fā)根農(nóng)桿菌RolA和RolC啟動(dòng)子等6。此外,楊英軍等克隆了proteinase omega基因的部分序列及其5

7、9;側(cè)翼序列。番木瓜葉組織GUS基因瞬間表達(dá)結(jié)果表明,該序列具有驅(qū)動(dòng)GUS基因在乳管中表達(dá)的功能7。1.3維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子(vascular bundle spe-cific promoter細(xì)菌和真菌性維管束病害常造成嚴(yán)重的損失,由于缺乏抗源,常規(guī)抗病育種進(jìn)展緩慢,加之維管束病害難以用藥劑防治,至今仍為生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題之一8。目前己經(jīng)鑒定的維管束特異啟動(dòng)子較少,研究比較深入的維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子主要有:菜豆GRP118(富甘氨酸細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白、擬南芥profilin2基因和菜豆苯丙氨酸氨裂合酶PAL基因的啟動(dòng)子。Keller等以427bp GRPI.8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因,發(fā)現(xiàn)GUS

8、基因在轉(zhuǎn)基因煙草中呈維管束特異表達(dá)9。曾慶銀克隆了銀杏木質(zhì)部特異定位表達(dá)基因啟動(dòng)子并在煙草中進(jìn)行了功能研究,初步證明銀杏GRPI.8基因啟動(dòng)子具有韌皮部表達(dá)特性10。Christensen等從擬南芥cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)中克隆了4種pfn基因,即pfn1、pfn2、pfn3、pfn411。劉昱輝等在對(duì)pfn2啟動(dòng)子作5端缺失分析中發(fā)現(xiàn),-1667-1bp pfn2全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因伽藍(lán)菜的根、莖、葉中均呈維管束特異表達(dá)12。Bevan等在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯中發(fā)現(xiàn),菜豆PAL2啟動(dòng)子(全長(zhǎng)1200bp驅(qū)動(dòng)GUS基因在莖的木質(zhì)部、皮層、表皮細(xì)胞、根尖、花瓣著色區(qū)和花粉粒中均有特異表

9、達(dá)13。1.4塊莖特異表達(dá)啟動(dòng)子(tuber specific promoter馬鈴薯GBSS基因在各器官中均有表達(dá),但在塊莖與匍匐莖中最高。經(jīng)研究表明馬鈴薯GBSS基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在匍匐莖和塊莖中的表達(dá)比葉片高125350倍,且高濃度蔗糖等因素可誘導(dǎo)GBSS基因高水平表達(dá)14。宋東光利用分離到的馬鈴薯匍匐莖尤其是塊莖中高水平的patatin啟動(dòng)子將乙肝表面抗原基因構(gòu)建于patatin啟動(dòng)子調(diào)控之下,使乙肝表面抗原基因在馬鈴薯中得到高表達(dá)15。此外,Molnara等研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖StMCPI和SbM-CPI啟動(dòng)子都具有塊莖和漿果器官特異性16。1.5根特異表達(dá)啟動(dòng)子(root t

10、issue specific promoter根是植物體吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。Borisjuk等用根特異啟動(dòng)子mas2、GFP和煙草鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin基因構(gòu)建融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)基因煙草水培研究結(jié)果表明,根細(xì)胞不僅能夠高效產(chǎn)生GFP,而且可將目的蛋白質(zhì)分泌到液體培養(yǎng)基中17。此外,應(yīng)奇才等運(yùn)用松樹根特異性啟動(dòng)子PmPgPR10驅(qū)動(dòng)CMO/BADH雙價(jià)基因并轉(zhuǎn)入水稻,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根和葉的CMO 酶、BADH酶活性及其它生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明:CMO/BADH雙價(jià)基因可在根部特異性表達(dá)18。2生殖器官表

11、達(dá)的特異性啟動(dòng)子2.1花粉組織特異性啟動(dòng)子(pollen specific pro-moter花粉發(fā)育相關(guān)的組織特異性啟動(dòng)子在花粉發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。花粉發(fā)育有關(guān)的組織特異性啟動(dòng)子如TA29,Lat52,Osg6B,Zm13,S1等得到了較詳細(xì)研究。Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseT1融合后轉(zhuǎn)化植物,核酸酶基因在花藥中特異表達(dá),并破壞絨氈層,獲得雄性不育煙草和油菜19,20,目前已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上應(yīng)用并獲得成功。Bate等在西紅柿中發(fā)現(xiàn)了Lat52基因,該基因在花粉成熟時(shí)首先在花粉的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)21。

12、Bp4基因家族是從甘藍(lán)型油菜中分離得到的,為花粉特異表達(dá),Zm13啟動(dòng)子為玉米的花粉特異啟動(dòng)子,從擬南芥中分離得到的A9的啟動(dòng)子也可以驅(qū)動(dòng)該基因在花藥絨氈層特異表達(dá)。多基因家族Profilin是高等植物中的一類低分子量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,在不同的條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架的聚合和解聚。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有五種Profilin(PRF,其中PRF1,PRF2,PRF3為組成型表達(dá)基因,在所有生長(zhǎng)細(xì)胞中均呈強(qiáng)表達(dá)而222007年第6期PRF4,PRF5則為花粉特異性表達(dá),成熟花粉以外的細(xì)胞包括小孢子中均無(wú)表達(dá)22。2.2花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子(flower specific pro-moter就花卉育

13、種技術(shù)來(lái)說(shuō),花卉的品種和色澤是育種中最為關(guān)鍵的因素。對(duì)花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究可克服傳統(tǒng)育種技術(shù)選育稀有花色品種的難度大等問(wèn)題。UBC6基因是從擬南芥中分離出來(lái)的編碼一種與泛素連接酶(ubiqutin conjucting enzymes同源的基因,Watts等通過(guò)將UBC6啟動(dòng)子與GUS 基因融合轉(zhuǎn)入擬南芥的研究表明:該基因主要在花和種子中表達(dá),在裂開前的成熟花藥、萼片和授粉后的花柱,以及花絲頂端的維管組織和心皮中均能表達(dá)23。苯丙氨酸裂解酶(phenyl alanine ammonialyase,PAL基因啟動(dòng)子,輔酶A連接酶(4 coumarate:coenzyme A ligase,

14、4CL基因啟動(dòng)子和CHS基因啟動(dòng)子是與苯丙酮(phenyl propanoid代謝關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子,研究表明在各種花器官中都能夠有效地驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá),尤其是花瓣中具有很強(qiáng)的表達(dá)特性24,25。另外,Annadana等克隆了菊花UEP1啟動(dòng)子并與4個(gè)異源啟動(dòng)子(矮牽牛的chs2A和EPF225,擬南芥的CER6以及馬鈴薯的PMC比較發(fā)現(xiàn):UEP1啟動(dòng)子在傘形花序和花盤小花的花瓣中表達(dá)量最高,是CaMV35S啟動(dòng)子的50倍26。馬沁沁等從秈稻川75A(Oryza sativa L黃化苗葉片中獲得水稻花藥絨氈層特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tsp1,序列分析發(fā)現(xiàn),該片段與Osg6B啟動(dòng)子同源性為96%,且

15、具有真核生物啟動(dòng)子的多種特征序列,該啟動(dòng)子為水稻花藥絨氈層特異表達(dá)的啟動(dòng)子27。2.3果實(shí)特異表達(dá)啟動(dòng)子(fruit specific promoter植物的發(fā)育是基因時(shí)空調(diào)控表達(dá)的結(jié)果,而這一過(guò)程往往通過(guò)激素的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。乙烯在果實(shí)成熟過(guò)程中起重要作用,它通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)協(xié)調(diào)與相關(guān)基因的表達(dá),使果實(shí)色、香、味和質(zhì)地發(fā)生改變直至成熟。植物果實(shí)相關(guān)基因啟動(dòng)子一般與乙烯形成有關(guān),研究比較深入的有E4、E8、PG、2A12基因的啟動(dòng)子與ACC合酶啟動(dòng)子。E4基因是與果實(shí)成熟相關(guān)的乙烯應(yīng)答基因,其近端區(qū)161bp就可使基因表現(xiàn)出果實(shí)成熟時(shí)乙烯誘導(dǎo)的特性,乙烯應(yīng)答區(qū)被定位在-161-85的區(qū)段內(nèi)28;E

16、8基因?qū)儆诠麑?shí)成熟調(diào)控類基因,其啟動(dòng)子在葉中表達(dá)較弱,在花藥和果實(shí)中高水平表達(dá),該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-409-263序列為成熟調(diào)控區(qū),是在成熟過(guò)程中表達(dá)所必需的29;因此,E4、E8基因啟動(dòng)子的作用是各自獨(dú)立的,皆具有果實(shí)成熟信號(hào)誘導(dǎo)元件和乙烯誘導(dǎo)元件。多聚半乳糖醛酸酶(PG基因通常在非成熟果實(shí)中不表達(dá),在果實(shí)成熟過(guò)程起始后其mRNA才可被檢測(cè)到。該基因5上游231bp的區(qū)段為最小的成熟誘導(dǎo)啟動(dòng)子,推測(cè)在-231-134及-806-433區(qū)段之間分別有一個(gè)正調(diào)控區(qū),負(fù)責(zé)基因在外果皮細(xì)胞和內(nèi)果皮細(xì)胞中表達(dá),與E8基因啟動(dòng)子序列相比,無(wú)明顯的同源性。類似的研究還有番茄PG基因啟動(dòng)子和蘋果PG基因

17、啟動(dòng)子,它們驅(qū)動(dòng)基因在果實(shí)成熟時(shí)特異性表達(dá)。多基因家族編碼的ACC合成酶在乙烯的產(chǎn)生過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)已從番茄、綠豆、蘋果、康乃馨、馬鈴薯、獼猴桃、筍瓜、小西葫蘆等植物中分離到ACC合成酶基因30。王新力等發(fā)現(xiàn)香蕉ACC合成酶基因的啟動(dòng)子與番茄E4、E8、PG基因啟動(dòng)子相似性只有25%,同時(shí)也沒有番茄E4、E8啟動(dòng)子中的E4/E8蛋白結(jié)合位點(diǎn)及乙烯應(yīng)答元件31。此外,哈斯阿古拉等應(yīng)用PCR方法從甜瓜基因組中擴(kuò)增出甜瓜類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶(即黃瓜素, cucumisin基因自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至上游310bpDNA 片段,序列分析表明該序列與已報(bào)道的相應(yīng)序列完全相同,具有TATA-box、CAAT

18、-box、G-box、I-box-like和增強(qiáng)子元件TGTCACA等功能域,具有典型的果實(shí)特異性啟動(dòng)子特征32。2.4種子特異表達(dá)啟動(dòng)子(seed specific promoter種子特異表達(dá)啟動(dòng)子是利用用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得果實(shí)無(wú)核性狀的關(guān)鍵。利用種子特異性啟動(dòng)子與影響種子形成的相關(guān)基因融合,如生長(zhǎng)素合成酶基因、細(xì)胞分裂素基因等,使其在種子發(fā)育初期大量表達(dá),從而影響種子形成,或與核酸酶基因融合,專一性阻斷種子發(fā)育的某一進(jìn)程,最終導(dǎo)致果實(shí)無(wú)核性狀。Rotino等將子房特異性表達(dá)啟動(dòng)子DefH9與IaaM基因(IAA合成酶基因融合,并將其導(dǎo)入茄子和煙草中,單性結(jié)實(shí)株率達(dá)50%,且座果率多數(shù)在90%

19、以上,該試驗(yàn)說(shuō)明,運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù),在子房中專宋揚(yáng)等:植物組織特異性啟動(dòng)子研究23生物技術(shù)通報(bào)Biotechnology Bulletin2007年第6期一性地表達(dá)生長(zhǎng)素合成酶基因,能誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)33。種子貯藏蛋白是人類食用蛋白的重要來(lái)源之一,而這些基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的時(shí)間和空間調(diào)節(jié)。由于我國(guó)大部分小麥品種的蛋白中缺少小麥麥谷蛋白5亞基,從而直接影響到面包的烘烤品質(zhì)。Chen等通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了小麥麥谷蛋白5亞基結(jié)構(gòu)基因(sub5及其啟動(dòng)子(Psub5序列,得到了含有目的基因的表達(dá)載體,希望通過(guò)基因工程的方法將該表達(dá)載體用于小麥的品質(zhì)改良34。棉花的蕾、花、鈴等生殖器官是害蟲危害的主要器官,由

20、于目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉所用的啟動(dòng)子都是CaMV35S啟動(dòng)子,它所驅(qū)動(dòng)的殺蟲基因在棉花的根、莖、葉中表達(dá)量較高,而在棉花的蕾、花、鈴等主殖器官中的表達(dá)量較低,致使目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉出現(xiàn)“前期抗蟲性高,后期抗蟲性下降”的生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題。任茂智等分離的棉花Nodulin-like瘤素(Nodulin蛋白和腺普酸核糖基化作用因子arf1兩個(gè)啟動(dòng)子,具有較強(qiáng)的啟動(dòng)活性和組織器官特異性,Nothern blot,、GUS組織化學(xué)分析和GUS熒光定量分析結(jié)果表明這兩個(gè)啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)基因在棉花的蕾、花、鈴等生殖器宮中高效表達(dá)35。此外,Digeonj用IPCR的方法克隆了小麥puroindo line基因的啟動(dòng)子36

21、。Vincent等也率先獲得了柏樹PtNIP1基因的胚胎發(fā)育特異性啟動(dòng)子37。這些啟動(dòng)子的調(diào)控不僅受到組織細(xì)胞生理狀態(tài)和化學(xué)物理信號(hào)等物質(zhì)的誘導(dǎo),還受到發(fā)育階段的調(diào)控,其表達(dá)是多種因素相互作用的結(jié)果。例如,豌豆胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制子基因啟動(dòng)子的種子特異表達(dá)還受到干旱脅迫的誘導(dǎo)38。在組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控下,基因的表達(dá)常常只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位,并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展,這一特性必然使組織特異型啟動(dòng)子作為一種重要的順式作用元件在生物反應(yīng)器,選育抗蟲、抗病、抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良品種等領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1楊予濤,等.中國(guó)科

22、學(xué)C輯,2003,33(4:298306.2王利軍,等.西北植物學(xué)報(bào),2004,24(10:185618603M itsutakataniguchi,Katsuraizaw A,M aurice SB.Plant Cell Physiol, 2000,41(1:4248.4蔣浩,秦紅敏,虞紅梅.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1999,7(1:6368. 5蔣浩,秦紅敏,田穎川.林業(yè)科學(xué),1999,35(5:4650.6張海利,呂淑霞,田穎川.中國(guó)生物工程雜志,2003,11:1115. 7楊英軍,周鵬.云南植物研究,2005,27(5:545551.8王新力,彭學(xué)賢.生物工程學(xué)報(bào),2001,17(4:42

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