(完整word版)免疫毒性試驗

1、免疫毒性試驗的指導原則（草案）本指導原則是為了有助于藥品安全性的正確評價，對申報藥品審評時所做免 疫毒性試驗提供的標準實施方法。但是。對于所有的藥品進行完全一樣的免疫毒 性試驗，有時也不盡合理，重要的是：應根據(jù)對象藥品的特性采用最適宜的試驗 方法。背景在清除細菌和病毒等外來病原體以及體內(nèi)產(chǎn)生的癌細胞等，并維持生體正常 的過程中，免疫系統(tǒng)起著重要的作用。免疫功能低下容易導致機會感染和產(chǎn)生腫 瘤，這在免疫功能缺乏癥和獲得性免疫功能缺乏綜合征（ AIDS ）的病例中是人們 所熟知的。對免疫系統(tǒng)的有害作用（免疫毒性）與其他毒性不同，與其說是其直 接對患者的生存帶來威脅，不如說由外來病原體的侵襲和內(nèi)在性

2、癌細胞的發(fā)生時 產(chǎn)生的免疫毒性更有害。關于藥品審評申報的非臨床免疫毒性試驗，雖然指出了其重要性，但是，構 成免疫系統(tǒng)的細胞組織及其相互作用是復雜的，免疫功能的評價項目很多，除小 鼠之外的試驗動物，特別是毒性試驗中通常使用的大鼠，其免疫功能試驗方法的 評價尚未充分進行，這些都是實情，而且免疫功能試驗方法的設定較遲。然而， 近十年間， 包括國際性的共同研究， 免疫毒性試驗方法的評價取得了較大的進步， 即便是使用大鼠進行的免疫毒性試驗，也進入了堪稱充分而實用的階段。在本指導原則中，利用具有免疫毒性的諸多化學物質(zhì)在反復給藥毒性試驗時 與免疫毒性有關的檢查項目中出現(xiàn)異常的現(xiàn)象，其原則是，根據(jù)反復給藥毒性

3、試 驗的結果，在懷疑存在免疫毒性的場合下，進而再做免疫毒性試驗。免疫毒性包括抑制免疫功能、變態(tài)反應、自體免疫以及其他的免疫功能異常 亢進等，但本指導原則并未將試驗藥物特異性的免疫反應（藥物變態(tài)反應和藥物 特異性的自體免疫）作為研究對象。 （注 1）根據(jù)本指導原則，在符合表 1 的某一項時，必須進行免疫毒性試驗。生物制 品及應用生物技術的藥品不列入本指導原則的對象。指導原則的目的 為了有效地進行藥物免疫毒性的檢查及其性質(zhì)的研究，必須根據(jù)預測的免疫 毒性選擇最適宜的試驗方法和擬定實驗方案。本指導原則的目的是提供進行非臨 床免疫毒性試驗時可供參考的 實驗 程序和檢查項目的選擇標準。本指導原則中，作為

4、檢查免疫毒性的試驗，是在過去一直沿用反復給藥毒性 試驗的基礎上，增設第 1 階段免疫毒性試驗（第 1 階段試驗）及第 2 階段免疫毒 性試驗（第 2 階段試驗）。包括與反復給藥毒性試驗相關的免疫毒性的檢查項目 和第 1 階段試驗的主要目的是篩選藥物，這些藥物對免疫系統(tǒng)可能會顯示出直接 或間接的毒性。在第 1階段試驗中可以同時了解對體液性免疫的影響；第 2 階段 試驗的目的在于從質(zhì)量上和數(shù)量上證明免疫毒性的大小程度。關于免疫毒性試驗的實施方法，其技術進步很快，可以預料：比本指導原則 所記述的試驗法更為優(yōu)異的方法即將被開發(fā)。當著人們進行試驗之際，在參考本 指導原則的同時，還應經(jīng)常獲取新技術，努力改

5、進檢查方法。檢查項目的選擇 本指導原則所列示的檢查項目被認為是最低限度的要求，根據(jù)試驗藥物的不 同性質(zhì)，可以考慮適當增加檢查項目。反復給藥毒性試驗的免疫毒性有關檢查項目為臟器重量、血液檢查（血液學 檢查及血液化驗）以及組織病理學檢查中與免疫系統(tǒng)有關的項目。同時，在反復 給藥的毒性試驗中，建議增加末梢血液淋巴細胞亞群檢查及脾臟免疫組織化驗等 項目（表 2-1 ）。從反復給藥毒性試驗的免疫毒性有關檢查項目及增加的檢查項目 中發(fā)現(xiàn)異常時（注 2），才作免疫毒性試驗。免疫毒性試驗分為 2個階段。第1 階段試驗進行抗體生成的檢查以及脾臟和 胸腺臟器重量測定等檢查（表 2-2 ）。天然殺傷細胞（ NK ）

6、活性的檢查最好補充 到第 1 階段試驗中。第 1 階段試驗未見異常的時，可以不進行第 2 階段試驗。第 1 階段試驗出現(xiàn)異常時，結合反復給藥毒性試驗的結果后，進行包括適當檢查項目（表2-3 ）在 內(nèi)的第 2階段試驗。在第 2 階段試驗中，必須證明所列免疫毒性的性質(zhì)，特別應 弄清對受影響細胞和免疫功能鑒別的影響強度，這是尤為重要！ 。反復給藥毒性試驗中，斷定出現(xiàn)明確的免疫毒性，并從其毒性性質(zhì)而言進行 第 1 階段試驗的必要性很小時（注 3 ），可直接進行第 2 階段試驗。為了討論免疫毒性的可逆行，根據(jù)需要可對發(fā)現(xiàn)異常的項目進行恢復性試 驗。試驗實施的時期 通常第 1 階段試驗在反復給藥毒性試驗之

7、后進行，若有可能，也可以和反復 給藥毒性試驗同時進行。第 1 階段試驗，原則上應在臨床試驗開始以前進行；第2 階段試驗，根據(jù)需要可在適宜的時期內(nèi)進行。試驗方案第 1 階段試驗的試驗方案應遵照以下條件，需要進行第 2 階段試驗的場合， 應當制定與其目的最相宜的實驗方案。1. 動物種類、性別及周齡： 最好使用與反復給藥毒性試驗的免疫毒性有關檢查項目及增加的檢查項目中發(fā)現(xiàn)異常的動物為同一物種、相同種系、一樣的性別和周齡的動物（注 4）。反復給藥毒性試驗中未見雌雄差異時，可以使用雌雄中的任意一種動物（注 5）。2. 動物數(shù)量：每組不少于 8 只，應當設定為在統(tǒng)計學具有足夠數(shù)量的動物數(shù)。 各組動物的分配

8、采用隨機分組法。3. 給藥途徑：原則上為臨床應用的給藥途徑。4. 劑量等級：原則上應當設定不低于 3種劑量的給藥組， 并另設對照組。 參照反復給藥毒性試驗的免疫毒性有關檢查項目及增加的檢查項目中發(fā)現(xiàn)異常時的劑量，設定劑量的等級（注 6）。5. 對照組：設置僅用溶劑的陰性對照組。根據(jù)需要可以考慮增加正常對照組 （注7）及陽性對照組（注 8）。6. 給藥期間：原則上采用反復給藥毒性試驗為基準的給藥期間。通常每周給藥 7次。7. 觀察等：進行一般癥狀的觀察及體重測定。與免疫毒性有關的檢查項目 在反復給藥毒性試驗及免疫毒性試驗中，作為研究對象的免疫毒性有關檢查項目見表 -2。根據(jù)試驗藥物的性質(zhì)及試驗的

9、目的，可從這些檢查項目中選擇需要的項目，制定切實可行的試驗方案。注釋注 1 ：關于遲發(fā)型藥物變態(tài)反應，皮膚過敏試驗的指導原則已經(jīng)制定，但是速發(fā)型藥物變態(tài)反應的能夠很好預測的試驗方法迄今尚未建立。注 2：表-1 第 1 項（ 1）的內(nèi)容是指懷疑出現(xiàn)免疫毒性的場合。所謂免疫毒性有關檢查的異常是指在該項檢查中給藥組與陰性對照組之間存在統(tǒng)計學意 義的明顯差異，但應考慮試驗動物的標準數(shù)據(jù)等的范圍及其變化。注 3 ：例如，僅僅發(fā)現(xiàn)嗜中性白細胞減少，未見其他異常的場合等。注 4 ：通常使用小鼠及大鼠。注 5 ：在同一籠子中飼養(yǎng)多只雄性動物時，應當考慮籠子的大小，使之不會發(fā)生打斗等飼養(yǎng)方面的問題。注 6：高劑

10、量組是將與對照組比較體重抑制不超過 10% 的用藥量作為本組的劑量。設計劑量時必須做到：高劑量組應出現(xiàn)足夠多的異常，而低高劑量組不應 發(fā)生異常，希望得出給藥劑量與動物反應的某種關系。高劑量組異常的變 化很小，明確知道無須使用 3 種等級的劑量時，也可以使用 2 種劑量的給 藥組。注 7 ：通常沒有必要，但是所用溶劑對免疫毒性試驗產(chǎn)生影響時，必須設置正常對照組。注 8 ：設置陽性對照組的目的在于評價檢查手段是否妥當。如果采用了另一種方法進行試驗，即：使用少量動物觀察給予環(huán)磷酰胺等陽性對照藥物后的影 響，則可省去該陽性對照組。參考文獻1).種種試驗法bZ, Methods inImmunotoxi

11、cology Vols. 1 and 2( ed.by Burleson, G. R. ,et. al. );Environmental Health Griteria180.Principles and Methods forAssessing Direct ImmunotoxicityAssociatedwith Exposureto Ghemical.pp.164_225 (1996);Immu noTox Letter.（日本免疫毒性學會發(fā)行）揭載免疫毒性試驗口卜表-1本指導原則中免疫毒性試驗的對象藥物1. 依據(jù)下述（1 ）至（3）的任意一項，均被懷疑為試驗藥物存在免疫毒性時:（1）該

12、品反復給藥毒性試驗及其他毒性試驗的結果；（2）與具有免疫毒性的已知藥物的化學結構相似；（3）其他情況。2. 試驗藥物的臨床應用符合于下列（1 ）至（2）的場合（注1）:（1）免疫功能缺失癥；（2）與具有免疫抑制作用的藥物（注 2）聯(lián)合用藥。注1:具有合理理由時，可從試驗對象中排除。注2 :免疫抑制劑、抗癌藥物、抗變態(tài)反應藥物及甾體化合物等中具有免疫抑制 作用的藥物。表-2免疫毒性的有關檢查項目I反復給藥毒性試驗的檢查項目1. 一般狀態(tài)及體重；2. 血液學檢查：免疫毒性的有關檢查必須進行血細胞計數(shù)和測定白細胞的分類 百分率。3. 血液化驗：免疫毒性的有關檢查必須測定白蛋白/球蛋白比率（A/G）。

13、4. 臟器重量：免疫毒性的有關檢查必須測定脾臟、胸腺及腎上腺的重量。5. 組織病理學檢查：免疫毒性的有關檢查必須進行脾臟、 胸腺、淋巴結、骨髓、 腸道（包括淋巴集結）、肝臟、腎臟、腎上腺及皮膚的檢查。6. 最好增加末梢血液淋巴細胞亞群檢查及脾臟免疫組織化驗等項目。n第1階段免疫毒性試驗的檢查項目1. 抗體的生成：在給藥過程中的適宜時期，使用羊的紅細胞等T淋巴細胞依賴 性抗原進行免疫。將羊的紅細胞作為抗原使用，在空斑形成細胞（ PFC）測 定時，4天前測定血清的抗體值，67天前進行免疫。由羊的紅細胞進行免 疫采用靜脈內(nèi)給藥。測定空斑形成細胞（PFC）,最后一次給予試驗藥物的 第2天，制作每只動物

14、的脾臟細胞，并進行測定。測定血清抗體時，最后一 次給予試驗藥物的第2天，采集每只動物的血液，制作血清，一直保存到測定之時（根據(jù)需要可以冷凍）?？贵w的測定采用酶標記免疫吸附測定法（ELISA ）。2. 用于抗體生成檢查的試驗動物，應進行一般狀態(tài)、體重、脾臟重量、胸腺重 量以及其他一些特殊需要的項目進行檢查。3. 根據(jù)需要，可以進行天然殺傷細胞（NK）的檢查。為了進行天然殺傷細胞 （NK）的檢查，與抗體生成的檢查不同，必須設置給藥組及對照組。最后一次給予試驗藥物的第2天，制作脾臟細胞，使用適宜的標記細胞進行測定。m. n第2階段免疫毒性試驗的檢查項目1. 骨髓細胞的分類百分率：使用后肢骨骼。2.

15、淋巴細胞亞群的檢查：對于末梢血液以及脾臟的B淋巴細胞、T淋巴細胞、T淋巴細胞亞群和天然殺傷細胞（NK）,使用對于適宜表面標記等具有特異 性的抗體進行計數(shù)，并求出其組成比。也可以用流式細胞測量法進行檢查。3. 血液化驗：進行血清蛋白質(zhì)的電泳。4. 免疫球蛋白的分類檢查：最后一次給予試驗藥物的第2天，采集血樣，制作血清，保存（根據(jù)需要可以冷凍）。采用酶標記免疫吸附測定法（ELISA ）進 行免疫球蛋白的分類（IgM、IgG、IgA和IgE）水平的測定5. 免疫組織的化驗：對淋巴組織、腎臟（包括免疫復合物沉著）以及皮膚等的 免疫組織進行化驗。6. 免疫功能的檢查：（1 ）抗體生成的檢查：見上所述。（2）天然殺傷細胞（NK）活性的檢查：如上所述。（3）其他免疫功能的檢查：可以適當增加由 Mitogene等引起的淋巴細胞增殖 反應、細胞障礙性T細胞的活性、血清補體、細胞因子的生長、巨噬細胞和多 態(tài)型白細胞的吞噬活性、遲延型變態(tài)反應（注 1）、宿主抗性、淋巴結反應（注 1、注2）、瞬時型變態(tài)反應（注1）、自體抗體、尿蛋白以及其他的檢查。（注1 ）將這些變態(tài)反應用作指標，討論其抑制和亢進。（2）有時將自體免疫的激發(fā)活性作為指標。免疫毒性