液相芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用進(jìn)展

1、液相芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用進(jìn)展 09-09-25 14:50:00 作者：陳瑋編輯：studa20【摘要】 液相芯片是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的被喻為后基因組時(shí)代的新型芯片技術(shù)，具有高通量、靈活、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等眾多優(yōu)點(diǎn)，可用作蛋白質(zhì)和核酸等生物分子的高通量檢測(cè)平臺(tái)。本文簡(jiǎn)要介紹其原理、優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)該技術(shù)在基礎(chǔ)研究、臨床診斷等方面的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。 【關(guān)鍵詞】 液相芯片； Luminex； xMAP技術(shù) 【Abstract】 Suspension array, a novel and powerful postgenomic era tool, was first devel

2、oped in 1997 based on Luminexs xMAP technology. Featuring many remarkable advantages such as highthroughput, flexibility, rapidness and multiplexing ability, suspension array provides an open platform for assays of protein, nucleic acid and biomolecular interaction analysis. Here we provided brief i

3、ntroduction of its principle and advantages, and reviewed applications of this new array technology in basic research and clinical diagnosis. 【Key words】 suspension array; Luminex; xMAP technology 液相芯片，也稱(chēng)為微球體懸浮芯片（suspension array，liquid chip），是基于xMAP（flexible MultiAnalyte Profiling）技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)，它是在

4、不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原抗體、酶底物、配體受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)，通過(guò)紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光來(lái)達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。迄今為止十年時(shí)間，全球已有數(shù)百套基于xMAP技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)、核酸檢測(cè)、基因研究等領(lǐng)域，該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具，也是最早通過(guò)美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）認(rèn)證的可用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)。 1 液相芯片技術(shù)的原理 液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球（直徑5.55.6 m）為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種微球上固定

5、有不同的探針?lè)肿?，將這些微球懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了一個(gè)液相芯片系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)可以對(duì)同一個(gè)樣品中的多種不同分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，這種被稱(chēng)之為xMAP的檢測(cè)技術(shù)是1997年由美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)出來(lái)的。 在液相系統(tǒng)中，為了區(qū)分不同的探針，每一種固定有探針的微球都有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號(hào)，或稱(chēng)熒光編碼。在微球制造過(guò)程中摻入了紅色和橙色兩種熒光染料（這兩種染料各有10種不同區(qū)分），從而把微球分為100種不同的顏色，形成一個(gè)具有獨(dú)特光譜地址的含有100種不同微球的陣列。不同顏色微球在分類(lèi)激光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光互不相同，這種分類(lèi)熒光是識(shí)別不同微球的唯一途徑。利用這100種微球，可以分別標(biāo)記上100

6、種不同的探針?lè)肿印?檢測(cè)時(shí)先后加入樣品和報(bào)告分子與標(biāo)記微球反應(yīng)，樣品中的目的分子（待檢測(cè)的抗原或抗體、生物素標(biāo)記的靶核酸片段、酶等）能夠與探針和報(bào)告分子特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報(bào)告分子藻紅蛋白，隨后利用儀器（如Luminex 100）對(duì)微球進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果分析。Luminex 100采用微流技術(shù)使微球快速單列通過(guò)檢測(cè)通道，并使用紅色和綠色兩種激光分別對(duì)單個(gè)微球上的分類(lèi)熒光和報(bào)告分子上的報(bào)告熒光進(jìn)行檢測(cè)。紅色激光可將微球分類(lèi)，從而鑒定各個(gè)不同的反應(yīng)類(lèi)型（即定性）；綠色激光可確定微球上結(jié)合的報(bào)告熒光分子的數(shù)量，從而確定微球上結(jié)合的目的分子的數(shù)量（即定量）。因此，通過(guò)紅綠雙色激光的同時(shí)檢測(cè)，

7、完成對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)、定性和定量分析。 2 液相芯片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 液相芯片技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)在于：僅需少量樣本即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)同一樣本中的多種不同目的分子，即多重檢測(cè)（multiplexing）。具體說(shuō)來(lái)，與常規(guī)免疫學(xué)或核酸檢測(cè)方法相比，液相芯片技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)。 2.1 高通量 可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)、定性、定量分析。從理論上說(shuō)，如果不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)的通量等于微球的種類(lèi)數(shù)，目前最多可達(dá)到100種。這遠(yuǎn)勝過(guò)一次只能檢測(cè)一個(gè)項(xiàng)目的傳統(tǒng)免疫分析法。 2.2 樣本用量少 由于在同一個(gè)反應(yīng)孔中可以同時(shí)完成100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，所以大大節(jié)省了樣本用量，少至1l的樣本即可檢

8、測(cè)，非常適合分析小體積稀有樣品。 2.3 操作簡(jiǎn)單、快速 由于是基于液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此反應(yīng)速度快，孵育時(shí)間比傳統(tǒng)的固相檢測(cè)短。進(jìn)行免疫學(xué)分析時(shí)，若使用高親和力抗體，23 h內(nèi)即完成檢測(cè)，而核酸雜交分析在PCR擴(kuò)增后1 h內(nèi)可得到結(jié)果。 2.4 靈敏度高 微球表面積大，每個(gè)微球上可包被100 000個(gè)捕獲抗體，如此高密度的捕獲抗體保證了能夠最大程度地與樣本中的抗原分子結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度。最低檢測(cè)濃度可達(dá)到0.1 pg/ml. 2.5 檢測(cè)范圍廣 可達(dá)35個(gè)數(shù)量級(jí)（如BioRad公司細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)范圍達(dá)到0.232 000 pg/ml，樣品無(wú)需濃縮或稀釋。 2.6 特異性強(qiáng) 無(wú)需洗滌

9、就能夠自行將和微球結(jié)合的與未結(jié)合的分子區(qū)分開(kāi)來(lái)，只讀取單個(gè)微球上的熒光信號(hào)，信噪比好。 2.7 準(zhǔn)確性高 微球上的報(bào)告分子熒光強(qiáng)度與結(jié)合的待測(cè)分子成正比。由于液相芯片技術(shù)的檢測(cè)范圍大，因此不需要象ELISA檢測(cè)中那樣需將樣本多倍稀釋?zhuān)瑥亩鴾p小了誤差。 2.8 重復(fù)性好 這是由于：第一，與ELISA依靠酶放大作用的比色讀數(shù)相比，液相芯片技術(shù)中的熒光讀值更加直接、穩(wěn)定、靈敏；第二，每種微球檢測(cè)100個(gè)，最終取熒光強(qiáng)度的中值作為結(jié)果，這相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)了100次，而ELISA僅為雙復(fù)孔或三復(fù)孔，因此液相芯片檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性是ELISA無(wú)法比擬的。 2.9 費(fèi)用低 同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中的

10、多項(xiàng)指標(biāo)可節(jié)約時(shí)間、樣本、試劑、耗材和勞動(dòng)（比ELISA法低10100倍），降低檢測(cè)成本，同時(shí)還提高了分析效率，僅需少量樣本即可獲得大量信息。目前同時(shí)檢測(cè)10項(xiàng)細(xì)胞因子的液相芯片試劑的費(fèi)用大約為1300/96孔（130/項(xiàng)/96孔），這比檢測(cè)單項(xiàng)指標(biāo)的ELISA試劑的成本（500/項(xiàng)/96孔）低得多，而且還可隨檢測(cè)指標(biāo)的增加而進(jìn)一步降低費(fèi)用。 2.10 靈活 適用于各種蛋白質(zhì)和核酸的分析。商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯(lián)微球和標(biāo)記分子即可滿(mǎn)足不同檢測(cè)項(xiàng)目的需要。 3 液相芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展 液相芯片是繼平面芯片之后的一種新型芯片技術(shù)，是一種非常靈活的多元分析平臺(tái)，在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子

11、的大規(guī)模分析中具有巨大的應(yīng)用潛力，可用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體配體識(shí)別分析等眾多領(lǐng)域的研究，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析等都可以在同一個(gè)平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)。鑒于液相芯片技術(shù)在高通量定性和定量檢測(cè)上令人矚目的優(yōu)勢(shì)，目前它在基因組學(xué)研究、蛋白質(zhì)組學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)、基礎(chǔ)研究和臨床診斷等方面的應(yīng)用十分廣泛，近幾年來(lái)以此為平臺(tái)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和應(yīng)用十分活躍，研究者既可以根據(jù)研究需要自行制備探針交聯(lián)微球，建立反應(yīng)體系，也可使用種類(lèi)繁多的商品化試劑盒進(jìn)行分析。大體說(shuō)來(lái)，液相芯片技術(shù)的應(yīng)用包括兩大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原抗體反應(yīng)，而后者實(shí)質(zhì)為核酸雜交?，F(xiàn)將液相芯片技術(shù)

12、在檢測(cè)細(xì)胞因子、病原微生物、基因突變以及HLA、基因表達(dá)分析、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究等方面的應(yīng)用綜述如下： 3.1 定量檢測(cè)細(xì)胞因子 細(xì)胞因子參與多種免疫機(jī)能，某些細(xì)胞因子具有相同功能，并且調(diào)節(jié)其它細(xì)胞因子的合成和分泌，因此同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子有利于全面判斷機(jī)體免疫功能、了解分子水平的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，在疾病的診斷、病程觀(guān)察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測(cè)方面有重要意義，還可用于研究發(fā)病機(jī)制、藥物作用機(jī)理和藥物臨床試驗(yàn)。 目前最常用于檢測(cè)體液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的方法有ELISA、TRFIA等，這些方法靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性都較好，但是也存在一些局限：每次僅能檢測(cè)一種細(xì)胞因子，如果需要同時(shí)分析多種細(xì)

13、胞因子，則檢測(cè)費(fèi)用較為昂貴并且費(fèi)時(shí)，完成檢測(cè)所需的樣本量較大，非常浪費(fèi)，對(duì)于一些量少的樣本（如鼠血清、兒童患者標(biāo)本）就比較困難。能夠同時(shí)檢測(cè)數(shù)種細(xì)胞因子的方法有RTPCR、Northern Blot等，但它們均不能準(zhǔn)確定量分泌性細(xì)胞因子，而且每次檢測(cè)的細(xì)胞因子數(shù)目有限。 用傳統(tǒng)方法檢測(cè)多種細(xì)胞因子時(shí)，要求的樣品量多，費(fèi)用高，ELISA的檢測(cè)范圍僅12個(gè)數(shù)量級(jí)，而液相芯片可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中的多種分子，而且具有特異、快速、靈活、重復(fù)性好的特點(diǎn)，其檢測(cè)范圍為34個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)靈敏度也遠(yuǎn)勝于ELISA，其優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。因此定量檢測(cè)細(xì)胞因子成為目前液相芯片技術(shù)應(yīng)用最為活躍和廣泛的領(lǐng)域之一，尤其是2

14、004年以來(lái)，隨著市場(chǎng)上越來(lái)越多的商品化試劑盒的涌現(xiàn)，液相芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量迅猛增加，大有取代常規(guī)ELISA方法之勢(shì)。 de Jager1自行制備抗體交聯(lián)微球，同時(shí)檢測(cè)了人血漿和關(guān)節(jié)滑液中的30種細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子，其檢測(cè)靈敏度為1.026.4 pg/ml，檢測(cè)范圍達(dá)4個(gè)對(duì)數(shù)值；檢測(cè)添加上述分子正常人血漿的回收率為83%119，平均批內(nèi)變異系數(shù)為8.1，平均批間變異系數(shù)為11.4；液相芯片與ELISA法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2為0.880.99。 國(guó)外多家公司已推出了商品化的細(xì)胞因子液相芯片檢測(cè)試劑盒，比如R&D 公司的Flurokine MAP系列、Linco Res

15、earch公司的LINCOplex 試劑盒、BioSource公司的Antibody Bead Kit、BioRad公司的BioPlex系列等，可用于來(lái)自人、小鼠、大鼠的樣品，既有一次檢測(cè)單種細(xì)胞因子的試劑盒，也有預(yù)先混合多種細(xì)胞因子抗體交聯(lián)微球而一次檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)者，研究者還可根據(jù)自身需要自行選購(gòu)某幾種交聯(lián)微球。這些試劑盒在檢測(cè)靈敏性、準(zhǔn)確性、可靠性等方面都具有很好的性能，如BioRad公司的BioPlex細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，其靈敏度可達(dá)24 pg/ml，最高檢測(cè)濃度可達(dá)16 00032 000 pg/ml，線(xiàn)性檢測(cè)范圍為35個(gè)數(shù)量級(jí)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于10。不過(guò)這些試劑盒均未獲得FDA用

16、于體外診斷的批準(zhǔn)，僅限于實(shí)驗(yàn)研究用途。如Funding2 用BioRad公司的BioPlex試劑盒同時(shí)定量測(cè)定角膜移植排斥患者房水中的17種細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)這些患者的細(xì)胞因子水平顯著增高。Szodoray3用Biosource公司的試劑盒檢測(cè)了9名原發(fā)性Sjogren綜合征患者血漿中可能與細(xì)胞死亡有關(guān)的25種細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞因子水平在患者與健康人之間差異顯著，作者認(rèn)為能同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子的液相芯片技術(shù)可成功用于診斷Sjogren綜合征及個(gè)性化抗細(xì)胞因子治療。 與傳統(tǒng)ELISA方法相比，液相芯片除了能同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、全血、組織勻漿液、淚液、腦脊液甚至新生兒干血斑等標(biāo)本

17、中的多種細(xì)胞因子，一次檢測(cè)即可確定Th1/Th2特異性免疫應(yīng)答，能為了解免疫應(yīng)答中的細(xì)胞因子分泌情況提供更為全面的信息外，還至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：比ELISA靈敏度更高，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在更低的濃度仍能保持線(xiàn)性：這是因?yàn)橐合嘈酒cELISA依靠酶放大作用的間接檢測(cè)相比，熒光讀值更直接、穩(wěn)定、靈敏；此外，液相芯片檢測(cè)中洗滌更徹底，微球表面積小，減少了非特異性結(jié)合；而且交聯(lián)抗體是共價(jià)結(jié)合于微球上，這不同于ELISA依靠疏水作用通過(guò)物理吸附與固相載體結(jié)合。比ELISA更準(zhǔn)確：液相芯片最后報(bào)告的熒光值為100個(gè)微球熒光檢測(cè)結(jié)果的中值，相當(dāng)于重復(fù)進(jìn)行了100次檢測(cè)。更經(jīng)濟(jì)：一次可對(duì)1020余種細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析，

18、檢測(cè)單種細(xì)胞因子的試劑用量顯著降低，樣本需要量少（最多僅需100 l），而ELISA檢測(cè)同樣數(shù)目的細(xì)胞因子需要數(shù)毫升樣本。據(jù)估算，同時(shí)檢測(cè)8種人細(xì)胞因子的費(fèi)用僅為ELISA的1/17，樣品用量?jī)H為后者的1/20，因此大大節(jié)省了人力、時(shí)間和費(fèi)用。 3.2 檢測(cè)SNP 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸改變所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類(lèi)可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每5001 000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬(wàn)個(gè)甚至更多。隨著人類(lèi)

19、基因組計(jì)劃的完成，基因組多態(tài)性研究，尤其是SNP檢測(cè)，已經(jīng)成為一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)。 利用液相芯片技術(shù)進(jìn)行SNP分析的研究報(bào)道已有很多，在此平臺(tái)上可應(yīng)用多種不同的SNP基因型分析方法，如單堿基鏈延伸法（single base chain extension，SBCE）、等位基因特異性引物延伸法(allelespecific primer extension，ASPE)、寡核苷酸連接法、直接雜交法、競(jìng)爭(zhēng)雜交法等。 采用液相芯片技術(shù)進(jìn)行SNP分析，96孔板上每孔可檢測(cè)50種SNP，儀器分析96個(gè)孔的數(shù)據(jù)只需1小時(shí)，這樣每臺(tái)儀器每天（8h）可完成30 000個(gè)以上基因型的檢測(cè)，每個(gè)SNP的平均檢測(cè)費(fèi)用

20、據(jù)估算不到0.20（不包含PCR費(fèi)用），并且主要取決于SNP數(shù)目、聯(lián)檢項(xiàng)目數(shù)量、標(biāo)本數(shù)量、人力和試劑費(fèi)用等因素。因此，用液相芯片進(jìn)行SNP分析比DNA測(cè)序或者基因芯片操作簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、通量高、費(fèi)用低，而且單管反應(yīng)即可檢測(cè)多種SNP，在研究SNP與疾?。ㄐ难芗膊　⒎逝?、腫瘤等）發(fā)生、法醫(yī)鑒定等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。Nishihama4 為評(píng)價(jià)有或無(wú)冠心病常見(jiàn)危險(xiǎn)因素（高血壓、高血脂、糖尿?。┱呋蚨鄳B(tài)性與心肌梗塞之間的關(guān)聯(lián)，采用液相芯片法（PCR與序列特異性寡核苷酸探針雜交）確定了3 483人（1 192名心肌梗塞患者、2 291名對(duì)照）137個(gè)候選基因的16

21、4種多態(tài)性的基因型，發(fā)現(xiàn)9種不同的多態(tài)性與心肌梗塞顯著相關(guān)（P0.005），冠心病常見(jiàn)危險(xiǎn)因素不同者其心肌梗塞相關(guān)基因多態(tài)性也不同。 目前也已推出用于SNP檢測(cè)的液相芯片試劑盒，如Tm Bioscience公司有用于臨床同時(shí)檢測(cè)因子V Leiden突變（G1691A）、凝血酶原（G 20 210 A）、MTHFR C677T和MTHFR A1 298 C突變、檢測(cè)導(dǎo)致囊性纖維化的CFTR基因突變的遺傳性疾病檢測(cè)試劑盒（囊性纖維化檢測(cè)試劑盒是被FDA批準(zhǔn)的首個(gè)人類(lèi)疾病多重基因分型體外診斷試劑），很適合用于高通量臨床基因分型。Marligen Biosciences公司的YSNP鑒定系統(tǒng)和線(xiàn)粒體D

22、NA篩選系統(tǒng)可分別檢測(cè)人Y染色體上的96種SNP和人線(xiàn)粒體DNA超變區(qū)的30種SNP。 3.3 檢測(cè)病原體和診斷感染性疾病 應(yīng)用液相芯片技術(shù)不僅可用免疫學(xué)方法檢測(cè)機(jī)體感染病原體（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等）后產(chǎn)生的血清抗體，或直接檢測(cè)病原體抗原，也可在基因水平上檢測(cè)病原體的核酸，其用途十分廣泛，如血清學(xué)診斷、病原體分型、疫苗效力評(píng)價(jià)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物反恐等。這方面的研究報(bào)道很多，一般都將液相芯片和傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果比較。 Lukacs5 制備了抗原交聯(lián)微球，不需洗滌步驟即可同時(shí)檢測(cè)新生兒干血斑標(biāo)本中的乙肝表面抗原、HIV1 p24、gp41抗體和丙型肝炎病毒NS3

23、、NS4、核心抗原的抗體。Martins6在微球上交聯(lián)A組鏈球菌的9種不同抗原（包括2種非特異性細(xì)胞外抗原、3種特異性抗原和4種與急性風(fēng)濕熱有關(guān)的組織抗原），定量分析患者感染A組鏈球菌后血清中的抗體反應(yīng)。該方法僅需5 l血清，90 min即完成分析，對(duì)鏈球菌溶血素O（SLO）、DNaseB的測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)方法100相符，而且特異、靈敏，可檢測(cè)濃度1 ng/ml以下的抗體。Kuller7直接在微球上交聯(lián)全病毒抗原，用液相芯片技術(shù)檢測(cè)恒河猴血漿中的抗病毒IgG抗體，以篩選未感染猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒、猴皰疹病毒1型、猴免疫缺陷病毒的SPF動(dòng)物，并與ELISA比較檢測(cè)靈敏性、特異性

24、、交叉反應(yīng)性和通量。結(jié)果表明，這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果高度相關(guān)（相關(guān)系數(shù) r 為0.980.99），液相芯片靈敏度更高，卻又不影響其特異性（達(dá)100），不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，而且由于該方法的假陽(yáng)性率低，因而可減少需用Western確證的血清樣品數(shù)量。在時(shí)間方面，用液相芯片同時(shí)檢測(cè)樣品中抗4種病毒抗體所需的時(shí)間與ELISA檢測(cè)抗單種病毒抗體所需時(shí)間相等。因此液相芯片在靈敏度、穩(wěn)定性、通量等檢測(cè)性能方面較ELISA更勝一籌。此外還有用液相芯片技術(shù)檢測(cè)鼠疫桿菌、炭疽桿菌、EB病毒、西尼羅河病毒、流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、弓形體、小隱孢子蟲(chóng)等病原體特異性抗體的報(bào)道。 09-09-25 14:50:00

25、作者：陳瑋編輯：studa20 Straub11先采取自動(dòng)化的免疫磁珠分離技術(shù)從樣品中分離大腸桿菌O157:H7、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌，然后通過(guò)標(biāo)記引物進(jìn)行多重PCR，最后用液相基因芯片同時(shí)檢測(cè)上述三種細(xì)菌。結(jié)果表明其檢測(cè)限為100個(gè)菌/種。 用液相芯片技術(shù)進(jìn)行病原體基因檢測(cè)和分型鑒定可將核酸雜交分析的特異性、可靠性及液相芯片技術(shù)的快速、靈敏性結(jié)合起來(lái)，PCR 1 h后即可完成鑒定，能精確區(qū)分相差一個(gè)核苷酸的不同種屬細(xì)菌，靈敏度達(dá)到101103基因組拷貝或99.9%，96個(gè)標(biāo)本從提取DNA到確定4個(gè)HLA位點(diǎn)的基因型僅需5 h，是一種高通量、簡(jiǎn)單、快速的HLA分型方法。在商品化試劑盒方面，One

26、 Lambda 公司的LABType SSO以及Tepnel Lifecodes公司的LifeMatch HLASSO 分型檢測(cè)試劑盒即是將生物素標(biāo)記的PCR靶片段與交聯(lián)于微球上的序列特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，可檢測(cè)出HLAA、B、C、DP、DQB1、DRB1、DRB3、4、5位點(diǎn)上的等位基因。 3.5 分析基因表達(dá) Flagella16采用支鏈DNA（branched DNA）與液相芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，直接從細(xì)胞裂解物、組織勻漿中定量檢測(cè)10種基因的mRNA表達(dá)情況，并可區(qū)分同源性大于95的基因。該方法無(wú)需RNA純化或者靶基因擴(kuò)增過(guò)程，而用支鏈DNA放大信號(hào)。其特異性高，交叉反應(yīng)0.2，

27、檢測(cè)靈敏度為25 000個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。 小分子RNA（miRNA）是一組保守的單鏈短RNA，約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，它們具有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用，是目前各國(guó)學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Lu17用液相芯片技術(shù)對(duì)來(lái)自334個(gè)標(biāo)本（包括多種人類(lèi)腫瘤）的217種哺乳動(dòng)物miRNA進(jìn)行了表達(dá)分析。觀(guān)察到miRNA表達(dá)譜可反映出腫瘤的細(xì)胞來(lái)源及分化狀態(tài)，腫瘤中的miRNA較之正常組織通常下調(diào)。作者將miRNA表達(dá)譜成功用于對(duì)分化不良的腫瘤進(jìn)行分類(lèi)，而mRNA表達(dá)譜用于同一標(biāo)本時(shí)卻非常不準(zhǔn)確。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明miRNA表達(dá)譜具有用于腫瘤診斷的潛力。此外，分析腫瘤相對(duì)于正常組織miRNA表達(dá)譜的變化還可篩選出感興趣的miRN

28、A，以深入探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。孫凱18 應(yīng)用液相芯片技術(shù)進(jìn)行肝細(xì)胞癌（HCC）及毗鄰癌旁組織中miRNA表達(dá)譜差異分析，并選取部分篩選出的差異表達(dá)miRNA，以半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）和Western blot分析其相對(duì)應(yīng)的靶mRNA和目的蛋白表達(dá)狀況。作者認(rèn)為液相芯片篩選差異表達(dá)miRNA可為研究HCC發(fā)病機(jī)制和診斷治療提供新的思路。 3.6 研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 Mu19為研究resistin是否對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞有直接作用，將人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用resistin處理，然后取細(xì)胞裂解液用BioRad公司的“磷酸化蛋白和總靶蛋白檢測(cè)試劑盒

29、”分析MAPK磷酸化蛋白和總蛋白，以二者的比值評(píng)價(jià)MAPK的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果表明，人resistin可通過(guò)活化ERK 1/2、p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)HCAEC增殖和遷移，提示人resistin可能在與血管發(fā)生有關(guān)的血管疾病中發(fā)揮作用。Sakai20為研究缺失突變的EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）的生物學(xué)作用，將轉(zhuǎn)染EGFR的293細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、PC9細(xì)胞在加入EGF培養(yǎng)后，取細(xì)胞裂解液用上述磷酸化蛋白檢測(cè)試劑盒定量分析EGFR、p44/42 MAPK、p38 MAPK、ATF2、JNK、IB、STAT3的磷酸化蛋白，以確定這些細(xì)胞經(jīng)EGF刺激后的下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 除了

30、上述應(yīng)用以外，液相芯片技術(shù)還可用于篩選過(guò)敏原、檢測(cè)自身抗體、腫瘤標(biāo)志物21及其他生物標(biāo)志物分子、研究酶/底物、DNA蛋白相互作用、蛋白蛋白等分子相互作用、分析蛋白表達(dá)等方面。 4 小結(jié) 液相芯片技術(shù)以其高通量、準(zhǔn)確、快速、靈敏、特異、多重檢測(cè)、操作簡(jiǎn)便、可定性定量等顯著優(yōu)點(diǎn)成為一種極具吸引力的大規(guī)模生物檢測(cè)平臺(tái)，幾乎可用于任何分子相互作用的檢測(cè)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著高特異性、高親和力抗體的產(chǎn)生以及微球、分析儀器和軟件的不斷發(fā)展改進(jìn)，能同時(shí)檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目還將不斷增加，靈敏度也將不斷提高，并逐漸實(shí)現(xiàn)儀器微型化和操作自動(dòng)化，該技術(shù)不僅將豐 09-09-25 14:50:00 作者：陳瑋編輯：studa20

31、 Straub11先采取自動(dòng)化的免疫磁珠分離技術(shù)從樣品中分離大腸桿菌O157:H7、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌，然后通過(guò)標(biāo)記引物進(jìn)行多重PCR，最后用液相基因芯片同時(shí)檢測(cè)上述三種細(xì)菌。結(jié)果表明其檢測(cè)限為100個(gè)菌/種。 用液相芯片技術(shù)進(jìn)行病原體基因檢測(cè)和分型鑒定可將核酸雜交分析的特異性、可靠性及液相芯片技術(shù)的快速、靈敏性結(jié)合起來(lái)，PCR 1 h后即可完成鑒定，能精確區(qū)分相差一個(gè)核苷酸的不同種屬細(xì)菌，靈敏度達(dá)到101103基因組拷貝或99.9%，96個(gè)標(biāo)本從提取DNA到確定4個(gè)HLA位點(diǎn)的基因型僅需5 h，是一種高通量、簡(jiǎn)單、快速的HLA分型方法。在商品化試劑盒方面，One Lambda 公司的LABT

32、ype SSO以及Tepnel Lifecodes公司的LifeMatch HLASSO 分型檢測(cè)試劑盒即是將生物素標(biāo)記的PCR靶片段與交聯(lián)于微球上的序列特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，可檢測(cè)出HLAA、B、C、DP、DQB1、DRB1、DRB3、4、5位點(diǎn)上的等位基因。 3.5 分析基因表達(dá) Flagella16采用支鏈DNA（branched DNA）與液相芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，直接從細(xì)胞裂解物、組織勻漿中定量檢測(cè)10種基因的mRNA表達(dá)情況，并可區(qū)分同源性大于95的基因。該方法無(wú)需RNA純化或者靶基因擴(kuò)增過(guò)程，而用支鏈DNA放大信號(hào)。其特異性高，交叉反應(yīng)0.2，檢測(cè)靈敏度為25 000個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。 小分子RNA（miRNA）是一組保守的單鏈短RNA，約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，它們具有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用，是目前各國(guó)學(xué)者的研究熱點(diǎn)。Lu17用