離體大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)放電活動一般特征的研究

1、離體大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)放電活動一般特征的研究                        作者：楊潤生，潘盛武，方穎，楊盛昌【摘要】  觀察離體大鼠海馬錐體細(xì)胞的生理電發(fā)放模式。在腦脊液孵育下，將玻璃微電極插入到離體大鼠海馬腦片錐體細(xì)胞附近，進(jìn)行胞外電脈沖記錄，微機(jī)記錄并保存電信號。共觀察到海馬部神經(jīng)元自發(fā)放電主要呈5種特征，分別為不規(guī)則發(fā)放、單波規(guī)則發(fā)放

2、、緊張發(fā)放、陣發(fā)排放及周期排放型等形式。說明神經(jīng)元的生理電發(fā)放模式可能與細(xì)胞的排列次序、生理應(yīng)答呈一定的相關(guān)性。 【關(guān)鍵詞】  大鼠海馬；微電極；腦片；自發(fā)放電    Abstract：To study the general characters of the rat hippocampus of the spontaneous electric activity of the ex-vivo pyramidal cells. We recorded the electrophysiology near the hippocampal pyramida

3、l cells of the rat limbic system by capillary glass microelectrode with continous perfusion of the artificial cerebrospinal fluid(ACSF).Results showed that five characters of spontaneous were recorded by the rat hippocampal cells,they were un-regulation release,single wave regular release,intension

4、release,paroxysm release and period release.It proves that the characters of the rat hippocampus of the spontaneous electric activity may connect with the arrangement of the cells,and the respondence of the stimulants.    Key words：Rat hippocampus；Microelectrode；Brain slice；Spontaneou

5、s discharge    1  引  言    邊緣系統(tǒng)是大腦皮層內(nèi)側(cè)皮質(zhì)包裹的部分腦區(qū)之一，其主要組成包括了海馬結(jié)構(gòu) (hippocampal)1。依據(jù)細(xì)胞的特性、分布和傳入的不同，將海馬分為四個區(qū)，即CA1、CA2、CA3和CA4。目前認(rèn)為，海馬組織主要參與學(xué)習(xí)和記憶，是學(xué)習(xí)和記憶的通道,神經(jīng)元的信息傳導(dǎo)功能主要是通過以電信號的形式進(jìn)行的，因此，微電極電生理記錄技術(shù)對揭示神經(jīng)元的工作狀態(tài)有很重要的研究價值。目前，用腦薄片技術(shù)研究哺乳類海馬錐體細(xì)胞的自發(fā)放電活動國內(nèi)尚未有相關(guān)報道，本研究使用大鼠海馬部作為腦薄

6、片研究材料，用玻璃微電極進(jìn)行細(xì)胞外電信號引導(dǎo)，微機(jī)記錄波形及電脈沖聲音，觀察神經(jīng)元自發(fā)放電特點。    2  材料和方法    2.1  材料    本實驗選用1月齡左右的大白鼠60只，雌雄不限。    2.2  實驗方法    在乙醚麻醉下快速斷頭，取出大腦，置于人工腦脊液（ACSF）的小燒杯中降溫1 min，然后在冰臺上用刀片進(jìn)行修整，保留所需部位，再用502膠水將其固定在振動切片機(jī)的推進(jìn)臺上，固定好后迅速向切片

7、槽內(nèi)倒入充有95%O2+5%CO2的ACSF,深度以浸沒腦薄片為宜，切好后用平板小勺子將腦薄片移入孵育槽內(nèi)的尼龍網(wǎng)上并立即進(jìn)行灌流。腦脊液灌流速度為23 ml/min。孵育12 h后可進(jìn)行實驗。    采集電極為玻璃微電極，尖端阻抗為46 M，內(nèi)充3 mol/L的NaCl，在微電極推進(jìn)器的幫助下，插入到海馬的CA1區(qū)進(jìn)行記錄，微機(jī)保存所得數(shù)據(jù)并同時進(jìn)行監(jiān)聽放電情況。    3  主要儀器設(shè)備及灌流液    TCL微機(jī)；HSS-1（B）型恒溫浴槽（成都儀器廠）；微電極拉制器（三菱公司，日本）；SW

8、F-2W微電極放大器（成都儀器廠）；RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；體視顯微鏡（麥克奧迪，廈門）；步進(jìn)式微電極操縱器（NARISHIGE,日本）；氧氣瓶；江灣V-4型振動切片機(jī)（上海第二軍醫(yī)大學(xué)）。    人工腦脊液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF)的配方2為（mmol/L）：NaCl124, KCl4、MgSO4·7H2O2、CaCl22、NaHCO3 26、NaH2PO4·2H2O1.25、Glucose10和蒸餾水，pH值在7.2左右，現(xiàn)配現(xiàn)用。  

9、  4  實驗結(jié)果     本實驗中，我們選擇在活性較好的海馬腦薄片標(biāo)本上CA1區(qū)處，共記錄到120個進(jìn)針位點的自發(fā)放電活動，根據(jù)其放電形式和特征，大致可歸納出以下幾種類型：    4.1  不規(guī)則發(fā)放    此類單位的數(shù)量為33/120，占27.5%。電信號單位出現(xiàn)的頻率、幅度及持續(xù)時間都不是很穩(wěn)定，單個發(fā)放與陣發(fā)夾雜進(jìn)行，最大峰峰值在1 600 V左右，不規(guī)則發(fā)放是本實驗中能觀察到的細(xì)胞放電類型中出現(xiàn)頻率較多的一類（見圖1）。 4.2  單波規(guī)則發(fā)放 

10、   此類單位的數(shù)量為50/120，占41.7%。電信號單位出現(xiàn)的頻率、幅度及持續(xù)時間都比較穩(wěn)定，其峰峰值是幾種類型發(fā)放中最大的一種。本實驗記錄中最大幅度可達(dá)8 000 V，一般的發(fā)放也可達(dá)到1 5001 800 V。本類電發(fā)放幅度均一，頻率穩(wěn)定，是本實驗?zāi)苡^察到的細(xì)胞放電類型中幅度最大，且出現(xiàn)頻率最多的一類波形（見圖2）。    4.3  緊張發(fā)放型    該型單位發(fā)放數(shù)量為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點是放電極為迅速，發(fā)放頻率相當(dāng)高，可達(dá)0.02 ms。幅度則較低，平均約1 000 V（見圖3

11、）。    4.4   陣發(fā)排放型    此類單位的數(shù)量較少，只有5/120，占4.1%。其特點是暴發(fā)期間隔很長，一般在37 s發(fā)放一次，最長間隔可達(dá)120 s以上，最大峰峰值在1 300 V左右。最密集的單次陣發(fā)排放可達(dá)60個波形以上（見圖4）。    4.5  周期排放型    本實驗中觀察到，以此類型發(fā)放的單位所占比率不高，為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點有明顯的周期性且呈串式發(fā)放，每串的放電為1124個波形，不同單位的發(fā)放周期不盡

12、相同，從幾秒到數(shù)十秒不等，每個單位的發(fā)放周期比較穩(wěn)定，每一周期內(nèi)可明顯地劃分為放電期和休止期，放電期的總脈沖數(shù)沒有一定的，放電幅度一般在1 500 V左右（見圖5）。5  討  論    海馬神經(jīng)元放電類型中的不規(guī)則發(fā)放型、單波規(guī)則發(fā)放、緊張發(fā)放型、陣發(fā)排放型及周期排放發(fā)等特征在海馬錐體細(xì)胞部是比較常見的電活動方式，究其原因，可能與錐體細(xì)胞的特征有關(guān)。海馬錐體細(xì)胞的胞體呈錐形，細(xì)胞排列整齊而緊密，其間只有少量的神經(jīng)細(xì)胞（如籃細(xì)胞、間隙細(xì)胞和門區(qū)細(xì)胞等）散布在各錐體層中，而CA1區(qū)的錐體細(xì)胞的頂樹突上的樹突棘結(jié)構(gòu)較簡單，當(dāng)微電極所處的位置合適時，

13、電信號就有可能發(fā)生諧振或減振等物理現(xiàn)象，從神經(jīng)元的應(yīng)答方面分析，不同的電信號則很有可能代表某種生理信息的表達(dá)。    據(jù)報道，在腦的許多結(jié)構(gòu)如大腦皮層2-3、下丘腦4、海馬3,5-6等存在KATP通道，但由于所采用細(xì)胞的發(fā)育水平不同和所用的記錄方式不同，所報道的KATP通道在激活條件、單通道電導(dǎo)、通道的整流特性、藥物作用等方面存在著很大的差異。其中，不規(guī)則連續(xù)放電、慢速放電、陣發(fā)性排放、周期性排放等四種基本類型與大鼠下丘腦薄片室旁核神經(jīng)元7，蟾蜍視頂蓋腦薄片神經(jīng)元自發(fā)放電的形式基本相似8，因動物種類、腦薄片部位等因素的差異而呈現(xiàn)不同的電發(fā)放特征，這些差異主要表現(xiàn)在

14、放電持續(xù)的時間、頻率、幅度以及潛伏期等方面?！尽?#160; 1孫久榮.神經(jīng)解剖生M.北京大學(xué)出版社,2004：226-227.2Ashford MLJ,Sturgess NC,Trout NJ et al.Adenosine-5-triphosphate sensitive ion channels in neonatal rat cultured neuronsJ.Pflugers Arch,1988,214:297-304.3Ohno-Shosaku T,Yamamoto C.Identification of an ATP-sensitive K+ channel in rat cul

15、tured cortical neuronsJ.Pflugers Arc,1992,422:260-266 4Ashford MLJ,Boden PR,Treherne JM.Glucose induced excitation of hypothalamicneurones is mediated by ATP-senditive K+ channelJ. Pflugers Arc,1990,415:479-483.5Politi DMT,Rogawski MA.Glyburde senditive K+ channels in cultured rat hippocampal neuron

16、s:activation by cromakalim and energy depleting conditionsJ.Mol Pharmacol,1991,40:308-315.6Zawar C,Plant TD,Schirra C，et al.Cell-type specific expression of ATP-sensitive potassium channels in the rat hippocampusJ.J Physiol(Lond),1999,514:327-341.7邪寶仁.5-HT對大鼠下丘腦腦薄片室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電活動的作用J.生理學(xué)報，1990，42：202-2

17、06.8楊盛昌,潘盛武.蟾蜍視頂蓋細(xì)胞自發(fā)活動特性腦片灌流研究J.廣西師范大學(xué)學(xué)報(版),1994，12(1):87-93. 1             4  實驗結(jié)果     本實驗中，我們選擇在活性較好的海馬腦薄片標(biāo)本上CA1區(qū)處，共記錄到120個進(jìn)針位點的自發(fā)放電活動，根據(jù)其放電形式和特征，大致可歸納出以下幾種類型：    4.1  不規(guī)則發(fā)放    此類單位的

18、數(shù)量為33/120，占27.5%。電信號單位出現(xiàn)的頻率、幅度及持續(xù)時間都不是很穩(wěn)定，單個發(fā)放與陣發(fā)夾雜進(jìn)行，最大峰峰值在1 600 V左右，不規(guī)則發(fā)放是本實驗中能觀察到的細(xì)胞放電類型中出現(xiàn)頻率較多的一類（見圖1）。 4.2  單波規(guī)則發(fā)放    此類單位的數(shù)量為50/120，占41.7%。電信號單位出現(xiàn)的頻率、幅度及持續(xù)時間都比較穩(wěn)定，其峰峰值是幾種類型發(fā)放中最大的一種。本實驗記錄中最大幅度可達(dá)8 000 V，一般的發(fā)放也可達(dá)到1 5001 800 V。本類電發(fā)放幅度均一，頻率穩(wěn)定，是本實驗?zāi)苡^察到的細(xì)胞放電類型中幅度最大，且出現(xiàn)頻率最多的一類波形（見圖

19、2）。    4.3  緊張發(fā)放型    該型單位發(fā)放數(shù)量為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點是放電極為迅速，發(fā)放頻率相當(dāng)高，可達(dá)0.02 ms。幅度則較低，平均約1 000 V（見圖3）。    4.4   陣發(fā)排放型    此類單位的數(shù)量較少，只有5/120，占4.1%。其特點是暴發(fā)期間隔很長，一般在37 s發(fā)放一次，最長間隔可達(dá)120 s以上，最大峰峰值在1 300 V左右。最密集的單次陣發(fā)排放可達(dá)60個波形以上（見圖4）。 

20、   4.5  周期排放型    本實驗中觀察到，以此類型發(fā)放的單位所占比率不高，為16/120，占13.3%。其發(fā)放特點有明顯的周期性且呈串式發(fā)放，每串的放電為1124個波形，不同單位的發(fā)放周期不盡相同，從幾秒到數(shù)十秒不等，每個單位的發(fā)放周期比較穩(wěn)定，每一周期內(nèi)可明顯地劃分為放電期和休止期，放電期的總脈沖數(shù)沒有一定的，放電幅度一般在1 500 V左右（見圖5）。5  討  論    海馬神經(jīng)元放電類型中的不規(guī)則發(fā)放型、單波規(guī)則發(fā)放、緊張發(fā)放型、陣發(fā)排放型及周期排放發(fā)等特征在海馬錐體細(xì)

21、胞部是比較常見的電活動方式，究其原因，可能與錐體細(xì)胞的特征有關(guān)。海馬錐體細(xì)胞的胞體呈錐形，細(xì)胞排列整齊而緊密，其間只有少量的神經(jīng)細(xì)胞（如籃細(xì)胞、間隙細(xì)胞和門區(qū)細(xì)胞等）散布在各錐體層中，而CA1區(qū)的錐體細(xì)胞的頂樹突上的樹突棘結(jié)構(gòu)較簡單，當(dāng)微電極所處的位置合適時，電信號就有可能發(fā)生諧振或減振等物理現(xiàn)象，從神經(jīng)元的應(yīng)答方面分析，不同的電信號則很有可能代表某種生理信息的表達(dá)。    據(jù)報道，在腦的許多結(jié)構(gòu)如大腦皮層2-3、下丘腦4、海馬3,5-6等存在KATP通道，但由于所采用細(xì)胞的發(fā)育水平不同和所用的記錄方式不同，所報道的KATP通道在激活條件、單通道電導(dǎo)、通道的整流特

22、性、藥物作用等方面存在著很大的差異。其中，不規(guī)則連續(xù)放電、慢速放電、陣發(fā)性排放、周期性排放等四種基本類型與大鼠下丘腦薄片室旁核神經(jīng)元7，蟾蜍視頂蓋腦薄片神經(jīng)元自發(fā)放電的形式基本相似8，因動物種類、腦薄片部位等因素的差異而呈現(xiàn)不同的電發(fā)放特征，這些差異主要表現(xiàn)在放電持續(xù)的時間、頻率、幅度以及潛伏期等方面。【】  1孫久榮.神經(jīng)解剖生M.北京大學(xué)出版社,2004：226-227.2Ashford MLJ,Sturgess NC,Trout NJ et al.Adenosine-5-triphosphate sensitive ion channels in neonatal rat cultured neuronsJ.Pflugers Arch,1988,214:297-304.3Ohno-S