大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞凍融與超聲破碎Word版

1、大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的超聲破碎及純化 一 可溶性蛋白的純化（一）菌體的破碎 1. 儀器與材料：-80冰箱；超聲波細(xì)胞破碎儀；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 離心管；冷凍高速離心機(jī)2.      方法2.1反復(fù)凍融  2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min  4離心15min，棄上清。2.1.2 菌體沉淀中加入相同菌液體積的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（選擇使蛋白穩(wěn)定的緩沖液和pH）重懸洗滌一次。2.1.3 然后按原菌液體積的1/4加入緩

2、沖液重懸菌體，并加入蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA(帶His標(biāo)簽不加)，PMSF終濃度為100g/ml, EDTA的終濃度為  。取20l重懸菌液進(jìn)行電泳，檢測蛋白表達(dá)的情況（是否表達(dá)，是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)）。2.1.4 將菌液（經(jīng)檢測有表達(dá)）在-80度冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次（反復(fù)凍融三次），由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。2.2  超聲波處理 (對超聲波及熱敏感的蛋白慎用)2.2.1 將反復(fù)凍融的菌液（必要時(shí)可加入1mg/ml 溶菌酶，緩沖液pH8.0，加入后需靜置20min），進(jìn)行超聲破碎，超聲條件：400

3、W，工作5秒，間隔5秒，重復(fù)一定次數(shù)，（根據(jù)我們的儀器找出一個(gè)比較好的工作條件）。直至菌體溶液變清澈為止，大約花費(fèi)時(shí)間   。2.2.2 取少量經(jīng)超聲破碎后的菌液，10000rpm離心10分鐘，分別對上清和沉淀進(jìn)行檢測，并用全菌作為陽性對照，檢測菌體破碎程度及目標(biāo)條帶占總蛋白的含量。注意事項(xiàng)：（1） 超聲破碎具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況而定，要掌握好功率和每次超聲時(shí)間，降低蛋白被降解的可能。（2） 功率大時(shí)，每次超聲時(shí)間可縮短，不能讓溫度升高，應(yīng)保持在4度左右，超聲時(shí)保持冰浴。（3）菌體破碎后總蛋白濃度的測定可用Bradford 法或者紫外吸收法。（4）可通過SDS-PAGE 電

4、泳觀察菌體破碎程度及目標(biāo)條帶占總蛋白的含量。二 包涵體蛋白的純化1        菌體的破碎 （加溶菌酶處理包涵體效果可能不好，包涵體中總是有殘留的溶菌酶，你看看有沒有不加溶菌酶的，這個(gè)先保留好了）1.1儀器與材料：超聲波細(xì)胞破碎儀；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml離心管；冷凍離心機(jī)1.2 方法(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min  4離心15min，棄上清。（2）菌體沉淀中加入相同菌液體積的20mM

5、 PBS 或20mM Tris-HCl（選擇使蛋白穩(wěn)定的緩沖液和pH，一般為7.5-8.0），重懸洗滌2-3次，棄掉上清。（3）然后沉淀按原菌液體積每500ml以15ml預(yù)冷的裂解液bufferA重懸。(有的文獻(xiàn)為每克濕菌加4ml -10ml裂解液)（4）每毫升懸液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶終濃度1mg/ml）。在冰上孵育15min（5）對15ml懸液進(jìn)行超聲破碎，超聲條件：400W，工作5秒，間隔5秒，重復(fù)一定次數(shù)。超聲破碎時(shí)保持冰浴。具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況而定。（6） 4，4000 rpm/min離心20分鐘所得沉淀即為包涵體。注意事項(xiàng)：融合蛋白的分子量如果大于150

6、KD時(shí)，用超聲波破碎很容易將目標(biāo)蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做處理.2 包涵體的洗滌(1) 將包涵體沉淀重懸于含有適量脲（1-4M）的Buffer A中，每克濕重加4-6ml洗滌液。(2) 超聲波處理5秒打碎沉淀，繼續(xù)用注射器吸入并擠出懸液，重復(fù)數(shù)次，4渦旋懸液30min?；蛘吒咚贁嚢钁乙?0min。(3) 4，4000 rpm/min離心15分鐘。(4) 重復(fù)上述操作2次至上清液透明無色。(5) 將包涵體沉淀重懸于Buffer A，4，4000 rpm/min離心15分鐘，棄掉上清。BufferA 50mM  Tris-HCl  pH 8, &#

7、160; 0.2mM  EDTA,   100mM  NaCl,   1%  Triton x-100 （或2% 脫氧膽酸鈉）   1mM    DTT   1mM    PMSF 溶菌酶 10mg/ml              注意事項(xiàng)：(1) 包涵體洗滌時(shí)增加NaCl濃度到0.5M，有助于包涵體中雜蛋白的溶解。(2) 經(jīng)提

8、取洗滌后得到的包涵體，由還原SDS-PAGE電泳結(jié)合光密度掃描可知包涵體中目標(biāo)蛋白的含量。(3) 包涵體洗滌是純化極為重要的一步，不同培養(yǎng)條件下收集的菌液經(jīng)洗滌可得到不同的純度。(4) 用通常的洗滌方法，如果包涵體達(dá)不到所需的純度，可試用分級沉淀法初純包涵體，步驟如下：(1) 菌體破碎后將所得的包涵體懸浮于含6mol/L鹽酸胍的Buffer A中，4渦旋懸液30min ，4000r/min離心20min，上清進(jìn)行分級沉淀。(2) 取一小部分上清用Buffer A稀釋到鹽酸胍濃度為4 M，然后4渦旋懸液15min，靜置30min，4000r/min離心20min，上清繼續(xù)稀釋到3M，重復(fù)上面操作

9、一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE電泳分析，看目標(biāo)蛋白在哪個(gè)鹽酸胍濃度下純度最高。(3) 摸索好條件后，直接將剩余上清直接用Buffer A稀釋到所需的鹽酸胍濃度，然后4渦旋懸液15min，靜置30min，4000r/min離心20min，沉淀既為分級沉淀后的包涵體。蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度測定方法很多，每種方法都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)以及適用范圍，不同的實(shí)驗(yàn)條件下得到的蛋白測定濃度需要根據(jù)純化蛋白緩沖體系選擇合適的測定方法。一、考馬斯亮藍(lán)法（bradford法）在本實(shí)驗(yàn)室中主要用來檢測經(jīng)谷胱甘肽親和層析柱純化后蛋白濃度測定（一）實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán)法（bradford法），是根據(jù)蛋

10、白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 /&BIe  bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： G_Z |  （1）靈敏度高%w  （2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、tris

11、緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。 za1z:+t  此法的缺點(diǎn)是： （1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用G球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。 #（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑triton x-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。k%n­*  （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。+ （二）試劑與

12、器材 6  1. 試劑： ­Q*H:  （1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用 G球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍(lán)G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。 SY0;.Rg  2. 器材： =A7z­Uj g  （1）可見光分光光度計(jì) b Z!?4  （2）旋渦混合器 CV­|h6#  

13、;（3）試管16支 = HB!9  （三）操作方法 |O!=r   1. 標(biāo)準(zhǔn)方法（要用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方法參照pierce公司試劑盒，此方法可以保留，但是要加96孔板實(shí)驗(yàn)方法）$t  （1）取13支試管，1支作空白，其余試管分為兩組，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0(空白)、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮藍(lán)G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量

14、氣泡而難于消除）。2U:X  （2）加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1ml H2O加5.0ml 考馬斯亮藍(lán)G250試劑。 NI S3*  注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時(shí)間浸泡。 H（3）另取O.1mL未知濃度的蛋白溶液同上測定cL!3(In?  （4）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)

15、曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。 NL9V  0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。 ?8Zk7  2. 微量法 xtiRuXj6R  當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（10100 ug/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595nm的光吸收值。 RGFUB5 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。 W0 %G&am

16、p;shy;x  二、紫外吸收法 N1HF1l*優(yōu)點(diǎn)：1 紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。2 低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（NH4）2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測 。缺點(diǎn)：1 測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。2 若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾雖然可以適當(dāng)?shù)男Ｕ?，但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是

17、不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。 fVr)CI >Q9  3 進(jìn)行紫外吸收法測定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時(shí)的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。 H  （一） 280nm的光吸收法 M$因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。 %'Zu!h'6      測定：將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色

18、皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值A(chǔ)280。注意事項(xiàng)：1 蛋白質(zhì)濃度可控制在0.11.0mg/ml左右。2 通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，A280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋白質(zhì)的大致濃度。 ;l*=&A  （二） 280nm和260nm的吸收差法核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸

19、收值大于260nm的吸收值。通常： 純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260= 1.8 :Ds=#w 2:  純核酸的光吸收比值：  A280/A260 = 0.5 ;Scf%t_  測定：含有核酸的樣品蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。 '?I+  蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A2800.74×A260 4gnpIO-w  三 BCA法蛋白定量1 原理：BCA(bicinchoninic aci

20、d)是理想的蛋白質(zhì)定量方法。堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。2 特點(diǎn)：(1) BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結(jié)果，但螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結(jié)果有一定影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford法測定蛋白濃度。(2) 準(zhǔn)確靈敏, 線性范圍廣：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是102000µg/ml。(3) 經(jīng)濟(jì)實(shí)用：在微孔板中進(jìn)行測定，可大大節(jié)約樣品和試劑用量。  3 材料 BCA  A 液：pH 11. 25，1% N a2BCA （二鋅可寧酸鈉），2% Na2CO3 ·H2O，0.16% Na2 Tartrate，0.4% NaOH, 0.95%