實驗二 過氧化氫酶Km值的測定

1、教案首頁第 2 次課 授課時間：2006年11月5日11月9日課程名稱生物化學與分子生物學實驗課年級2006專業(yè)、層次臨床醫(yī)學本科授課教師許成山職稱助教課 型(大、小)小學時3授課題目（章、節(jié)）實驗二 過氧化氫酶Km值的測定基本教材或主要參考書自編生物化學與分子生物學實驗指導教學目的與要求：1、鞏固酶促反應有關參數(shù)的知識，加深理解Km值的定義；2、學習Hanes作圖法測定Km值的原理和方法；3、掌握滴定管的使用和滴定終點的判斷。大體內容與時間安排，教學方法：1、Km值的定義及求Km值的作圖方法（林-貝氏作圖法和Hanes作圖法） 5min2、過氧化氫酶Km值測定的原理 5min3、過氧化氫酶K

2、m值測定的注意事項 10min4、學生做實驗 100min教學方法：實驗+示教教學重點、難點：重點：1、Hanes作圖法求Km值2、過氧化氫酶Km值測定的原理3、滴定管的使用和滴定終點的判斷難點：過氧化氫酶Km值測定的原理教研室審閱意見：教研室主任簽名：年 月 日基本內容手段課堂設計和時間分配一、Km值的定義：二、Km值的作圖方法（一）雙倒數(shù)作圖法（林貝氏作圖法）（二）Hanes作圖法三、過氧化氫酶Km值測定的原理四、實驗操作五、注意事項六、實驗結果七、學生做實驗提問簡圖簡圖示范操作在實驗過程中進行巡視，注意糾正學生的不規(guī)范操作1min當酶促反應速度等于最大反應速度一半時的底物濃度即為Km值；

3、Km值是酶促反應的特征性常數(shù)。4min以1/S為橫坐標，以1/V為縱坐標求Km值。S/V為橫坐標，以S為縱坐標求Km值。5min1、H2O2在過氧化氫酶的作用下分解生成了H2O和O2；2、S=加入的H2O2的量；3、V=固定時間內反應掉的H2O2的量=加入H2O2的量剩余H2O2的量；4、剩余H2O2的量可通過KMnO4滴定測出：2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O1、只做第3步；2、表格下：將各瓶置于37水浴預熱5min改為室溫搖勻。10min1、加入1:1000稀釋血清0.5ml/瓶后保溫準5分鐘；2、硫酸的濃度較大，小心不要濺出!3、作圖應該用

4、坐標紙，標明有關參數(shù)4、滴定操作：（1）使用滴定管前要先檢查滴定管是否漏水或有堵塞；（2）滴定管使用前還要潤洗（加KMnO4至刻度線24ml處；（3）使用時，不能左右推動活塞（要以環(huán)指頂住管壁，拇指、食指和中指控制流量；（4）加滴定液時，液面要稍高于0，爾后排除尖端氣體；（5）讀數(shù)時，視線要與液面凹陷最低點平行。列表計算出有關數(shù)據(jù)，在坐標紙上作圖求出Km值。100min 小 結Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質，酶所催化的底物和酶促反應條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關，與酶的濃度無關。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時，Km值也不同。Km值愈大，酶與底物的親和力愈??；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。復習思考題、作業(yè)題已知某種酶的Km值為0.05mmol/L，試問要使此酶所催化的反應速度達到最大反應速度的80%時底物濃度應是多少？下次課預